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本实验原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞，采用特异性烟碱型乙酰胆碱受体激动剂-烟碱，观察胆碱能性抗炎通路激活后对小鼠肝脏Kupffer细胞的影响，并以生存率为指标，评估烟碱对肝脏Kupffer细胞的影响及全身炎症反应的治疗作用。第一部分，采用密度梯度离心的方法原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞，经苔盼蓝染色和流氏细胞仪对细胞活性和纯度进行鉴定；第二部分，采用荧光共聚焦显微镜和’Western的方法，检测小鼠肝脏Kupffer细胞中是否存在α7-乙酰胆碱受体(α7-ACh受体)；第三部分，采用Elisa方法，测定给予LPS后，原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞上清液和BALB/c小鼠血清中TNF-α、IL-10和HMGB-1的浓度变化；第四部分，将100只BALB/c小鼠(6-8周，雄性)随机分为四组(LPS组、LPS+Nic组、LPS+Nic+GdCl3组和LPS+Nic+左侧迷走神经切断组)，给予致死量的LPS15mg/kg，观察72小时内动物死亡率的变化。本实验结果证实，小鼠肝脏Kupffer细胞中存在α7-ACh受体，并探讨了小鼠肝脏Kupffer细胞在胆碱能性抗炎通路中的作用。
[目的]
原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞，并鉴定其活性和纯度；判断原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞中是否存在仅α7-ACh受体；研究烟碱对小鼠肝脏Kupffer细胞上清液及小鼠血清中炎症因子释放的影响；研究烟碱对内毒素血症小鼠死亡率的影响及肝脏Kupffer细胞在其中所起的作用。
[方法]
(1)每次取3-5只BALB/c小鼠(6-8周，重约16-18g，雄性)，采用Ⅳ型胶原酶消化、Percoll密度梯度离心的方法分离培养肝脏Kupffer细胞，经苔盼蓝染色和流式细胞仪检测细胞活性和纯度。(2)采用荧光共聚焦显微镜和Western的方法，鉴定原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞中α7-ACh受体的存在。(3)将小鼠肝脏Kupffer细胞分为七组(100nM LPS、100nM LPS+0.01mM Nic、100nM LPS+0.01mMNic+1μMα-BGT、100nM LPS+0.1mM Nic、100nM LPS+0.1mM Nic+1μMα-BGT、100nM LPS+1mM Nic、100nM LPS+1mM Nic+1μMα-BGT)；将小鼠随机分为六组(LPS组、LPS+左侧迷走神经切断组、LPS+Nic组、LPS+Nic组+左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+GdCl3组、LPS+Nic+GdCl3+左侧迷走神经切断组)。分别在给予Nic4h、12h和24h后，取小鼠肝脏Kupffer细胞培养上清液和小鼠心脏穿刺取血并离心后的血清，采用Elisa法分别测定TNF-α、IL-10和HMGB-1的浓度变化。(4)将100只BALB/c小鼠(6-8周，雄性)随机分为四组(LPS组、LPS+Nic组、LPS+GdCl3组和LPS+Nic+左侧迷走神经切断组)，腹腔注射致死剂量的LPS15mg/kg后，每12h观察一次，记录72小时内动物死亡率。
[结果]
(1)原代分离培养小鼠肝脏Kupffer细胞，活性和纯度均达80％-90％，符合实验要求；
(2)用FITC-αBGT标记原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞后，荧光共聚焦显微镜下可以观察到细胞膜上存在α7-ACh受体，Western结果亦证实了α7-ACh受体蛋白的表达；
(3)就Kupffer细胞培养上清液而言，与单纯LPS组比较，a)给予Nic后4h，TNF-α浓度降低，降低程度与Nic浓度呈剂量相关性。加α-BGT后，TNF-α浓度变化与LPS组相比无明显差异；b)给予Nic后12h，IL-10浓度升高，升高程度与Nic浓度呈剂量相关性。加入α-BGT后，IL-10浓度变化与LPS组相比无明显差异；c)给予Nic后24h，HMGB-1浓度降低，降低程度与Nic浓度呈剂量相关性。加入α-BGT后，HMGB-1浓度变化与LPS组相比无明显差异。就小鼠血浆而言，与单纯LPS组比较，a)给予Nic后4h，TNF-α浓度在LPS+左侧迷走神经切断组升高，在LPS+Nic组、LPS+Nic+左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+GdCl3组及LPS+Nic+GdCl3+左侧迷走神经切断组均降低；b)给予Nic后12h，IL-10浓度在LPS+左侧迷走神经切断组降低，在LPS+Nic组、LPS+Nic+左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+GdCl3组及LPS+Nic+GdCl3+左侧迷走神经切断组均升高；c)给予Nic后24h，HMGB-1浓度在LPS+左侧迷走神经切断组升高，在LPS+Nic组、LPS+Nic+左侧迷走神经切断组、LPS+Nic+GdCl3组及LPS+Nic+GdCl3+左侧迷走神经切断组均降低；
(4)与LPS组比较，LPS+Nic组死亡率显著降低，LPS+GdCl3组和LPS+Nic+左侧迷走神经切断组死亡率亦降低，但高于LPS+Nic组。
[结论]
Ⅳ型胶原酶消化、Percoll密度梯度离心法原代分离培养的肝脏Kupffer细胞，活性和纯度符合实验要求，是后续实验α7-ACh受体鉴定的基础。荧光共聚焦显微镜和Western结果均证实，原代分离培养的小鼠肝脏Kupffer细胞中存在α7-ACh受体。烟碱可以抑制Kupffer细胞和小鼠血清中早期炎症因子TNF-α、晚期炎症因子HMGB-1的释放，促进抑炎因子IL-10的释放，并呈剂量相关性；切断左侧颈部迷走神经或给予GdCl3，均使烟碱的抗炎作用减弱。烟碱能降低内毒素血症小鼠死亡率，该作用可以部分被左侧迷走神经切断或GdCl3拮抗。