目的:2011年FDA批准BRAF抑制剂维罗非尼用于治疗BRAF V600E突变以及晚期不能手术切除的黑素瘤患者。该药在经过一段临床实践治疗后,普遍产生耐药性。针对此问题,我们构建覆盖人基因组的siRNA文库质粒、运用siRNA文库筛选耐药黑色素瘤细胞株、高通量测序、测序后单一片段功能的验证以及逆转录病毒感染条件的探索这个5个方面进行了研究。以期待能从基因沉默这一方面进一步阐述临床肿瘤耐药机制。方法:通过化学法合成中间含有19个碱基随机排列的片段,以PCR扩增该片段互补序列形成双链DNA,并作为Gibson组装的插入片段。在此基础上,在逆转录病毒骨架pSOK质粒的特定位置通过Gibson Assembly的方法,将含有随机排列19个碱基的si RNA片段组装进入该质粒并进行相关鉴定。选取伴有BRAF V600E突变的黑色素瘤细胞株A375、MDA-MB-435和UACC62三种细胞。利用FDA批准用于治疗伴有BRAF V600E突变的黑色素瘤药物维罗非尼和曲美替尼进行文库筛选。确定细胞致死剂量后经siRNA文库筛选耐药细胞株,经结晶紫染色、ic50检测、q-pcr检测耐药相关基因、emt相关基因等进行各个方面的验证。同时,我们对筛选得到的耐药细胞株提取基因组dna,经pcr扩增测序片段后送检illuminahiseq测序平台进行检测。根据测序结果设计11对单一序列过表达质粒,并转染细胞构建单一片段过表达稳定细胞株,并进行耐药相关检测。为确保每个目的细胞有且只有一个逆转录病毒的感染,设计了2种逆转录病毒质粒(带g418抗性的psen-gfp质粒以及带bsd抗性的pseb-rfp质粒),同时检测病毒滴度、最佳感染时间和病毒储存时间稳定性等相关问题。结果:1.该sirna文库质粒一次组装数目约1.08x106,同时插入文库片段质粒的阳性率为91.7%,并且随机挑选的15个阳性菌落质粒测序没有发生重叠。实验结果表明,该sirna文库质粒已充分覆盖人基因组。2.维罗非尼对uacc62的致死剂量为50um,而a375和mda-mb-435细胞的致死剂量皆为25um。曲美替尼对三种细胞的致死剂量为20um。3.依次使用抗肿瘤药维罗非尼和曲美替尼的致死剂量对感染了逆转录病毒文库的a375细胞进行了筛选,分别成功筛选出a375v、a375t、a375vt和a375tv耐药细胞株。4.与对照组a375相比,耐维罗非尼细胞a375v对达拉非尼(靶向braf蛋白)、曲美替尼(靶向mek蛋白)以及顺铂和吉西他滨(二者皆为临床一线细胞毒性药物)药物具有更强的耐药性。5.对照组细胞a375和a375n19的ic50为0.18um,a375v的半数致死剂量大大提升至5.09um。6.tq-pcr检测结果显示,随机挑选的13个耐药相关基因、ras/raf/mek信号通路相关基因在耐药细胞株(a375v、a375t、a375vt和a375tv)中呈现显著上调趋势。emt相关基因cdh1、cdh2、vim、fox2、snail1和ocln基因在耐药细胞株中的表达也呈上调趋势。7.成功提取耐药细胞株的基因组dna并设计测序引物进行pcr扩增以送检illuminahiseq测序平台进行检测。8.随机挑选了11个单一sirna片段,9种片段的导入都能够增加原细胞a375的耐药性,实验结果也通过结晶紫染色进行了验证。9.随机挑选的耐药相关基因、ras/raf/mek信号通路以及emt相关基因的表达情况在a375tbrs(过表达单一sirna片段)中都呈上调趋势。10.挑选耐药细胞株测序所得峰度值最高的5个sirna片段,并经生物信息学分析确定这些片段的下游基因,这些基因在耐药细胞株(a375v、a375t、a375vt和a375tv)和a375tbrs中都呈上调趋势。11.选取tbr1、tbr3和tbr8(三种sirna片段)靶向的ncrna设计了相应的引物(ncrna-1到ncrna-25),经tq-pcr检测,这些ncrnas在耐药细胞株(a375v、a375t、a375vt和a375tv)和a375tbr3/5/7/8/9/10中都呈现上调趋势。12.逆转录病毒最佳收集时间为病毒包装后36h、48h、60h以及72h,感染A375细胞的最佳时间为4h左右。13.随着逆转录病毒储存时间的延长,所有病毒组的病毒滴度都呈逐渐下降趋势,4天后下降趋势最为明显。14.在相同逆转录病毒滴度,相同细胞密度以及相同感染时间的条件下,不同细胞的感染率具有明显差异。