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齐墩果酸-3-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸苷(calenduloside E,CE)是从龙牙楤木中提取的具有降糖、避孕、抗心律失常等多种药理活性的五环三萜类皂苷,为齐墩果酸(oleanolic acid,OA)的葡萄糖醛酸结合物。CE因毒性低、药理作用广而受到广泛关注。本文建立了选择性好、灵敏度高的能同时测定生物样品中CE及其活性代谢产物OA的液相色谱-质谱联用技术(Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry,LC-MS/MS),并根据CFDA指导原则进行方法学确证,采用该方法对CE的临床前药代动力学进行了研究。主要包括大鼠和犬口服给予CE后,测定血浆中的药物浓度,考察血药浓度随时间的变化规律;考察CE及其活性代谢产物OA在大鼠体内的组织分布和排泄特征;应用液相色谱串联高分辨飞行时间质谱(LC-TOFMS/MS)初步鉴定大鼠体内的代谢产物;使用特异性底物探针法考察CE对大鼠CYP450酶的抑制、诱导作用;基于Caco-2和MDCK-MDR1细胞模型,阐述CE给药后在大鼠肠道的吸收转运机制。一、CE在大鼠和比格犬体内的药物动力学研究CE经灌胃/口服低、中、高三剂量(大鼠为3.75,7.5和15 mg/kg;比格犬1.05,2.1和4.2 mg/kg)给药后,发现其在大鼠和比格犬体内的药动学过程均符合二室模型。除犬的MRT和Vd/F有差异外,大鼠和犬体内Tmax,t1/2,CL/F,MRT和Vd/F均不随给药剂量的增加而变化,AUC0-t,AUC0-∞和Cmax胃均与给药剂量呈线性相关,表明CE在给药剂量范围内有线性药动学特征趋势。以AUC0-t计算,在中剂量下,大鼠灌胃给药后的绝对生物利用度为0.067%,比格犬口服给药后绝对生物利用度为0.59%,比大鼠有所提高。比格犬多次给药后,给药第1天和第6天的Tmax、t1/2无显著性差异,AUC0-t、AUC0-∞的蓄积因子为:2.45和2.41,Cmax的蓄积因子为2.09,犬多次服药后在体内表现出轻度蓄积。大鼠口服给药后血浆中大部分采血点未检测到苷元OA,可能由于大鼠体内CE向OA转化率低,且CE生物利用度低,吸收少,血浆中的OA低于定量下限而检测不到。犬分别口服给予CE低、中、高三个剂量后,血浆中均可检测到少量的OA。口服给药之后,从OA的Tmx可以看出由于其脂溶性更强,CE向OA的生物转化和OA的吸收都是很迅速的。OA的药-时曲线呈双峰现象,可能由于OA的肝肠循环所致。静脉给药之后,仅3.5%的CE向OA转化,这表明在肝脏中极少的CE转化为OA。因此,口服给药后生成的OA是胃肠道和肝脏共同作用的结果。二、CE在大鼠体内的组织分布研究通过比较CE在大鼠体内各组织分布的特点,对CE在大鼠体内的靶向性及各组织的蓄积情况进行评价。给药0.5h～2h后,各组织中CE浓度基本达到峰值。CE在胃壁,小肠壁浓度较高,与胃肠道给药途径相关。给药12 h后,各组织中CE含量均有明显下降趋势,不足峰值的10%,说明CE在体内组织不易产生蓄积。OA在各组织中的分布趋势与CE在组织内的分布趋势基本吻合。用平衡透析法测定大鼠血浆中CE血浆蛋白率,30、100、300 ng/mL的CE平衡24 h后,血浆蛋白结合率均接近于100%,表明CE血浆蛋白结合率很高,在体内主要以与血浆蛋白结合的形式存在,提示在合并用药时应注意药物-药物相互作用。三、CE在大鼠体内的代谢与排泄研究用LC-TOF MS/MS法对CE给药后大鼠排泄物中代谢产物进行了鉴定,结果表明:CE可被肠道微生物水解生成苷元OA;OA的C3-OH和C28-COOH都可发生葡萄糖醛酸结合反应,C3-OH与葡萄糖醛酸结合生成原形CE,C28-COOH与葡萄糖醛酸结合生成CE的同分异构体齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷,两个位点都发生与葡萄糖醛酸结合齐墩果酸-3,28-0-葡萄糖醛酸苷;此外,C12和C13间的双键可发生还原;C12和C13间的双键也可发生氧化,生成环氧化合物。通过测定大鼠排泄物中CE和OA的含量,并对CE的同分异构体齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷进行相对定量。大鼠给药72 h后,CE和OA的排泄量基本上达到坪值;CE和OA及CE同分异构体累计排泄量占给药剂量百分比为28.90%。尿液排泄量较低(仅0.04%),说明肾排泄不是CE的主要排泄途径,主要以苷元的形式从粪便排出体外。四、CE对大鼠CYP450酶的影响基于特异性底物探针法评价CE对大鼠肝微粒体五种主要CYP450酶亚型(CYP 1A2、CYP 2D6、CYP 3A4、CYP 2C9 和 CYP 2C19)的作用。CE 给药后,大鼠体内肝微粒体的蛋白含量以及CYP450酶含量均没有明显的增加或减少,说明CE对大鼠肝微粒体五种细胞色素P450酶亚型既无诱导作用,也无抑制作用。五、CE在大鼠肠道吸收机制研究通过考察CE在大鼠肠道内容物中的稳定性发现CE在肠道可部分水解为苷元OA;将苷元在含有UDPGA的大鼠肠S9、肝S9或肠液中进行孵化,测定CE及齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷的生成量,发现苷元在大鼠肠壁中能发生广泛的葡萄糖醛酸结合反应,进而分别生成CE和齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷,同时发现更易生成后者,体内选择性还需进一步研究。CE的跨膜转运实验表明CE在Caco-2细胞单层模型中的表观渗透系数与OA接近,且跨膜前有2/5的CE转化为OA,但由跨膜吸收后的OA转化生成的齐墩果酸-28-0-葡萄糖醛酸苷含量却很少。因此,可推测CE在肠道中部分以原形吸收,部分通过水解为苷元后吸收,吸收后的成分中主要以CE的形式存在。此外MDCK-MDR1细胞模型的实验初步推测CE不是P-gp的底物。