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荧光发射包含光谱(频域)和时间(时域)两方面的信息,反映着物质的能级结构基本信息,所以它的测量涉及到许多主要的科学领域。尤其在生物物理、生物化学以及临床医学诊断等领域,荧光分析和测量技术因为具有非常高的灵敏度和分子特异性而获得广泛应用。
荧光分析方法有许多种,荧光光谱,荧光成像,荧光寿命,偏振测量等等,各自提供关于荧光物质的不同信息,因此以往要准确分析一个样品往往需要系统地进行一系列测量。但是许多生物化学样品没有足够的稳定时间来进行这一系列测量实验,另外这些分散的测量也无法对一个连续的生化过程进行动态监测,所以把多种荧光测量技术结合,研究具有光谱分辨和偏振分辨功能的荧光寿命成像技术引起了人们的兴趣。
到目前为止,人们主要是通过将扫描式的显微镜与荧光寿命技术,偏振检测技术等结合到一起对样品进行测量来获得多维的荧光信息。但是扫描需要移动庞大的成像系统或者搭载样品的平台,速度受到限制,并且在扫描过程中会不可避免的造成对样品微环境的干扰。为了消除这种干扰,在前人研究的基础上本论文将远程重聚焦成像技术引入传统的多维宽场荧光寿命显微成像系统当中,搭建一套新的由飞秒脉冲光源,基于远程重聚焦宽场扫描的三维显微系统和快速增强型CCD相机三个主要部分组成的具有光谱分辨和荧光寿命显微成像功能的多维荧光显微成像技术。
首先我们在实验中搭建了远程重聚焦系统并利用焦点成像的方法检测了远程重聚焦系统的成像效果。远程重聚焦系统是被设计为在广角光锥成像情况下同时满足的正弦条件和赫谢耳条件的成像系统,它能在一个小的三维空间内对物体成一个理想的像。接着用搭建好的远程重聚焦系统对连续光激发下的荧光微球进行空间三维成像,获得了初步的结果。
然后我们将远程重聚焦系统引入到宽场荧光寿命显微成像系统当中。在飞秒脉冲紫光的激发下,我们对荧光微球进行了有光谱分辨的三维的荧光寿命显微成像并获得了较好的结果。
最后我们还对系统的各向异性(偏振)成像进行了一个初步的探索并得到了荧光微球的各向异性荧光寿命成像的初步结果。
截止到本文完成的时候,我们已经初步完成了多维宽场荧光寿命显微成像系统的搭建,并利用这个系统实现了在对样品没有任何干扰的情况下仅用了一次实验就可以完成对荧光样品的一系列系统的荧光测量。同时也为进一步的实现实时的动态荧光监测完成了最重要的一步。