研究背景:急性肺损伤（ALI,acute lung injury）是一种常见动态变化的复杂的临床综合征,是急性呼吸窘迫综合征（ARDS）的早期阶段。临床上严重感染、休克、创伤、脓毒血症等均可引起ALI,主要表现为气促、呼吸窘迫、肺顺应性降低、非心源性肺水肿以及顽固性低氧血症,进而出现的一种或多种器官组织损伤发展为ARDS。急性肺损伤病死率高,且其发病率近年呈不断增高趋势,但目前其发病机制仍不清楚,尚无有效预防、治疗并显著降低其死亡率的策略,因此探讨ALI发病机制对其防治意义重大。肺微血管内皮细胞是肺毛细血管的主要构成成分,它被覆于血管内膜表面,是介于血液和组织之间的一层单层膜结构,具有半通透性,可以调控气体、小分子溶质等在血液于肺组织间隙交换,是一道重要的物理性屏障。ALI发生时肺泡上皮和肺微血管内皮通透性增加,血管内大分子物资外渗,从而导致肺泡与间质内积聚大量富含炎症细胞及促炎因子的水肿液,加之成纤维细胞及肺泡上皮细胞也能产生多种细胞因子,从而共同加重炎症反应。由此可见肺微血管内皮细胞（PMECs）及内皮屏障的破坏是诱发ALI的关键因素。Rab蛋白是存在于质膜和细胞器膜中的一类调节型的小分子GTP结合蛋白,是Ras超家族中最大的亚家族,具有GTP酶活性,能够结合GTP并将GTP水解,通过GTP-GDP的循环来调节囊泡的融合,并与Rab效应子一起参与运输囊泡到胞膜停靠的过程,通过介导囊泡运输,调节多种细胞膜表面受体分子的表达及功能。不同的Rab蛋白其功能也不相同:Rab1可以招募黏附因子P115参与囊泡出芽,调节囊泡在高尔基体上的锚定;Rab5与早期吞噬体形成相关,调节胞外信号分子的内吞。我们前期研究表明Rab1、Rab5等通过调控受体转运进而控制内皮屏障功能。但新型小G蛋白Rab26能否调控内皮屏障功能及其机制尚不清楚。基因治疗（gene therapy）是将具有正常功能的外源基因导入受体细胞,以置换或增补缺陷基因,从而达到治疗疾病目的。而将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体。基因载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体转染效率高,但是存在一系列安全问题,而大部分非病毒载体又普遍存在转染效率低下、制作工艺复杂的劣势,可见我们迫切需要研发一种新型基因载体,在实现目的基因高效转移的同时又能确保安全,这对基因治疗能否取得突破性进展意义重大。随着纳米医学的发展,纳米材料作为基因运载体成为其重要的研究方向。与传统载体如病毒载体、阳离子脂质体、高分子聚合物、各种纳米材料等相比,以DNA天然的生物分子作为材料的纳米载体,具有天然性、无免疫原性、靶向性较好、转染效率高、低毒或无毒等优势,并且通过A-T、G-C、A-U、C-G互补配对而自行组装而成的核酸纳米材料,其制作流程简单,还可以通过DNA-RNA杂交技术,携带小干扰RNA运载基因,实现基因沉默。本课题中我们将基因沉默技术（Rab26 siRNA）与纳米载体技术有机结合,充分发挥两者优势,用于研究肺微血管内皮细胞屏障功能,为治疗急性肺损伤提供新的思路。研究目的:1.自组装能够携带Rab26 siRNA的DNA纳米管。2.明确携带Rab26 siRNA的DNA纳米管系统对PMECs内皮屏障功能的影响。3.探讨Rab26调控PMECs内皮屏障功能的机制。研究方法:1.根据碱基互补配对原理,构建能够携带Rab26 siRNA的DNA纳米管（Rab26siRNA-NT）;使用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native PAGE）、激光动态光散射（DLS）对DNA纳米管进行表征。2.培养人肺腺癌耐顺铂株（A549/DDP）,Rab26 siRNA-NT转染A549/DDP后,使用激光共聚焦（CLSM）测A549/DDP对Rab26 siRNA-NT摄取的时间依赖性和浓度的依赖性;使用流式细胞术检测其转染效率;然后用Rab26 siRNA-NT转染A549/DDP,验证其沉默基因效果及对DDP杀伤A549/DDP的影响。3.使用LPS刺激HPMECs,WB检测Rab26的表达情况,Transwell法检测HPMECs渗透性的变化;Rab26 siRNA-NT及si NC-NT转染HPMECs,使用DMSO/LPS刺激HPMECs,然后通过Transwell法检测HPMVECs渗透性的变化。4.使用LPS刺激HPMECs,WB检测P62、LC3-II/I的表达情况;分别使用自噬激动剂、抑制剂处理HPMECs,Rab26 siRNA-NT转染HPMECs,WB检测P62、LC3-II/I表达情况,研究Rab26 siRNA-NT对HPMECs自噬的影响。5.Rab26 siRNA-NT转染HPMECs,CLSM检测β2-AR和TLR4的表达情况;使用TLR4 siRNA、β2-AR siRNA、TLR4 siRNA+β2-AR siRNA分别转染HPMVECs,WB检测细胞膜上β2-AR、TLR4表达情况,Transwell法检测肺微血管内皮细胞渗透性变化。6.野生型C57小鼠腹腔注射LPS构建小鼠急性肺损伤模型;按照成功建模的条件处理野生型C57小鼠及Rab26^-/-小鼠,同时使用PBS处理野生型C57小鼠及Rab26^-/-小鼠,通过肺组织HE染色、Transwell法测肺血管通透性、RT-PCR检测肺组织中TNFα、IL-6的表达,对比野生型C57小鼠及Rab26^-/-小鼠在PBS/LPS处理下肺部损伤的情况。研究结果:1.通过金属浴阶梯降温合成Rab26 siRNA-NT;Native PAGE结果显示Rab26siRNA-NT构建成功,产率较高且结构稳定;DLS结果显示DNA纳米管粒子大小均一,分布均匀。2.CLSM结果提示A549/DDP摄取Rab26 siRNA-NT具有时间及浓度依赖性;流式细胞术结果提示Rab26 siRNA-NT转染A549/DDP转染效率较高,6 h转染效率即达60%以上;RT-qPCR及MTT结果提示Rab26 siRNA-NT转染A549/DDP,可以抑制Rab26的表达,增强DD对A549/DDP的杀伤效应。3.LPS刺激HPMVECs抑制Rab26的表达,HPMVECs渗透性增大;Rab26siRNA-NT组较siNC-NT组肺微血管内皮渗透性显著增大,提示,敲低Rab26可以加重由LPS引起的内皮屏障功能破坏。4.LPS刺激HPMVECs抑制自噬;Rab26 siRNA-NT转染HPMVECs抑制自噬。提示,敲低Rab26可抑制细胞自噬。5.Rab26 siRNA-NT转染HPMECs,荧光CLSM检测发现β2-AR表达被抑制,TLR4的表达增强;使用TLR4 siRNA、β2-AR siRNA转染HPMECs,Westernblot结果提示:较对照组TLR4 siRNA组β2-AR表达增强,β2-AR siRNA组TLR4表达增强,TLR4siRNA+β2-AR siRNA组TLR4、β2-AR表达均被抑制;Transwell小室检测BSA渗透性结果显示:实验组相对于对照组HPMECs渗透性均显著增高;TLR4 siRNA组相对于β2-AR siRNA组HPMECs渗透性显著降低;TLR4 siRNA+β2-AR siRNA组相对于TLR4 siRNA组HPMECs渗透性显著增高。提示,敲低Rab26,β2-AR与TLR4受体间平衡被打破,进而破坏内皮屏障功能。6.LPS刺激后,与野生型C57小鼠相比,Rab26^-/-小鼠:肺组织HE染色显示肺泡壁增厚,肺泡萎缩塌陷更明显;肺血管通透性显著增高;TNFα、IL-6的表达显著增高。提示,敲除Rab26,小鼠在LPS刺激后显示出更为严重的肺部损伤。结论:1.成功构建并合成了Rab26 siRNA-NT;Rab26 siRNA-NT可高效转染细胞,有效抑制Rab26的表达。2.Rab26 siRNA-NT转染HPMECs抑制Rab26的表达,可导致自噬被抑制、β2-AR和TLR4受体间平衡被打破,进而影响HPMECs的屏障功能。3.基线水平的Rab26在急性肺损伤中起重要的保护作用,抑制Rab26可加重急性肺损伤。