辣根过氧化物酶（HRP）是一种由无色蛋白质和棕色铁卟啉组成的糖蛋白。目前,HRP广泛用于污水处理、食品工业和催化反应。然而,HRP提纯于植物,在纯化过程中很容易失活,使其生产成本普遍较高。严重阻碍了蛋白质在工业生产中的应用。因此,提高蛋白质分离和纯化的效率是生物工程领域的热门话题。本课题将双水相初步萃取法和多价苯硼酸磁性石墨烯材料进一步吸附分离相耦合应用于纯化辣根过氧化物酶,并取得了良好的效果,具体工作内容如下:（1）构建17R4/L35-盐双水相萃取体系初步分离纯化蛋白质。实验研究了17R4/L35浓度、盐的质量分数以及控温沉淀中电解质、pH对蛋白质分配效率的影响。优化实验条件如下:聚合物选用17R4,盐选用（NH₄）₂SO₄,萃取温度为20℃,控温沉淀时,加入电解质为柠檬酸三钠、体系pH=7.0、控制温度为30℃,此时体系的蛋白质的回收率为70-80%,取得了良好的初级分离纯化的效果。在本实验中,为了模拟辣根中未知的物质和环境,我们建立了模型实验,研究了9种目标物（糖类、色素、蛋白质）的分配情况。调节体系pH值、改变温度、添加无机电解质等手段最大程度去除杂质,以获得最佳的萃取条件。采用17R4-硫酸铵双水相体系在辣根粗酶液中分离纯化HRP验证模型的可行性,HRP粗酶液的最大萃取回收率达到69.47%,最大程度的去除了多糖、色素以及固体杂质等,从而成功地实现了HRP的初步分离纯化。获得了较满意的结果。（2）以PEI和4-甲酰基苯基硼酸作用配体合成了“多价”苯硼酸磁性石墨烯材料在双水相纯化辣根粗提液的基础上进一步选择性吸附辣根过氧化物酶。实验对吸附条件如d-PBA-GO@Fe₃O₄@PEI与辣根过氧化物酶之间的最佳吸附比、pH值、温度和时间等参数进行了优化。得到了最佳亲和吸附工艺条件:d-PBA-GO@Fe₃O₄@PEI对辣根过氧化物酶的最佳吸附比为2:3,最优吸附pH值为8.0,最优的吸附温度为35℃,最佳吸附时间是60 min,最佳吸附量达到546.39mg/g。HRP的吸附率达到88%。同时,选择性实验表明该体系对HRP表现出较强的选择性,可用于辣根中HRP的分离富集,纯化因子为1.92,比酶活为28.93 U·mg^-1,萃取回收率为65.20%。通过平衡吸附实验评价了d-PBA-GO@Fe₃O₄@PEI对辣根过氧化物酶的吸附性能。对亲和吸附剂d-PBA-GO@Fe₃O₄@PEI进行了回收再利用,从而有效地降低了体系的成本与物耗。最后,通过FT-IR和CD分析,证明该纯化方法对HRP的分子结构没有造成破坏。上述萃取结果表明,双水相初步萃取法和磁性材料进一步吸附法可成功用于天然邻羟基蛋白的分离纯化,具有良好的应用前景。