论文部分内容阅读
背景心肌肥厚是心脏体积增大伴或不伴有心室腔的增厚的一种重要的病理生理状态的代偿机制。最初心脏的增大是一种有益的代偿机制,但随着刺激因素的持续存在,这种代偿机制将演变成为失代偿机制,出现不良事件(包括心肌细胞胚胎基因的再表达以及心肌纤维化等)。如若再任其发展,将会出现心室扩张、心脏收缩和舒张功能障碍以及心力衰竭。研究证实左心室肥厚已经成为心血管疾病的独立危险因素,可显著增加猝死、室性心律失常、心肌缺血、心力衰竭等心血管事件的发生率,并可增加患者的死亡率。然而,心肌肥厚的发生发展机制至今尚未明确,临床上尚无有效的防治方法。因此,针对参与心肌肥厚的分子进行靶向药物干预可为防治心肌肥厚和心力衰竭提供新的研究方向。3,3’-双吲哚甲烷(3,3’-diindolylmethane,DIM)是十字花科植物提取物3-吲哚甲醇(indole-3-carbinol,I3C)的衍生物,属于吲哚类化合物。目前研究发现DIM能清除自由基,激活凋亡信号通路,并具有较强的抗氧化、抗血管新生以及促进多种肿瘤细胞凋亡作用。但DIM在心肌肥厚中的作用研究,目前国内外尚未见报道。DIM可通过影响丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/Akt、核因子-κB (NF-κB)等信号通路来发挥其抗癌、抗血管新生、抗炎等作用。但DIM是否会通过上述分子机制对心肌肥厚产生作用目前尚无研究证实。因此,对DIM在心肌肥厚中的作用及其作用的根本分子机制的研究,可为防治心肌肥厚提供新的靶点,并为防治心肌肥厚以及心肌肥厚所致的心力衰竭提供实验室工作基础和理论依据。本课题通过血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导H9c2大鼠心肌细胞构建体外细胞肥大模型并采用胸主动脉缩窄术建立小鼠心肌肥厚模型,运用C57BL/6野生型与AMPKa2基因敲除小鼠研究DIM对心肌肥厚的作用,并进一步探讨其相关机制。方法实验一：H9c2大鼠心肌细胞作为实验对象,通过AngⅡ(1κM诱导建立离体细胞肥大模型,并采用不同浓度DIM进行干预,分为：DIM低浓度(1μM)干预组、DIM中浓度(5μM)干预组和DIM高浓度(10μM)干预组。给予AngII+不同浓度DIM共同培养细胞24h后进行免疫荧光形态学检测并用实时定量PCR检测心肌细胞肥大分子标志物的：:nRNA表达水平,确定DIM最佳干预浓度。用实时定量PCR检测DIM最佳干预浓度对AngⅡ作用各时间点(0,6,12,24h)心肌细胞肥大分子标志物的mRNA表达水平的影响；通过western blot检测DIM最佳干预浓度对AngⅡ作用各时间点(0,15,30,60min)细胞中AMPKa和mTOR等心肌细胞肥大相关的重要信号通路分子的磷酸化与总蛋白表达水平的影响。实验二：选取8～10周龄、体重23.5～27.5g、雄性的野生型C57BL/6小鼠为实验对象,通过胸主动脉缩窄术构建心肌肥厚动物模型。喂药组小鼠予以含有0.05%DIM(浓度100mg/kg/day DIM)的特殊饲料。预防实验(喂药组小鼠术前1周至术后8周给药)分为4组：DIM+Sham组、DIM+AB组、、Vehicle+Sham组与Vehicle+AB组；治疗实验(喂药组小鼠术后1周至术后8周给药)分为4组：DIMR+Sham组、DIMR+AB组、、Vehicle+Sham组与Vehicle+AB组。手术8周后通过心脏超声检查、血流动力学检测评价各组小鼠的心功能；取材后比较各组小鼠的心重/体重比值(HW/BW)、肺重/体重比值(LW/BW)以及心重／胫骨长度比值(HW/TL);通过心脏大体拍照、H&E染色、WGA染色和PSR染色进行形态学检测；用实时定量PCR检测心肌肥厚与心肌纤维化的分子标志物的mRNA表达水平；通过western blot检测各组小鼠心肌组织中AMPKa和mTOR等心肌肥厚相关的重要信号通路分子的磷酸化与总蛋白表达水平。实验三：选取8-10周龄、体重23.5-27.5g、雄性的AMPKa2基因敲除(KO)小鼠为实验对象,通过胸主动脉缩窄术建立心肌肥厚模型,喂药组小鼠于术前1周至术后4周予以含有0.05%DIM(浓度：100mg/kg/day DIM)的特殊饲料。分为KO+Sham组、KO+AB组、KO+DIM+Sham组与KO+DIM+AB组。手术4周后通过心脏超声检查、血流动力学检测评价心功能；取材后比较各组小鼠的HW/BW、LW/BW及HW/TL;通过心脏大体拍照、H&E染色、WGA染色和PSR染色进行形态学检测；用实时定量PCR检测心肌肥厚与心肌纤维化的分子标志物的mRNA表达水平；通过western blot检测各组小鼠心肌组织中mTOR等心肌肥厚相关的重要信号通路分子的磷酸化与总蛋白表达水平。结果免疫荧光结果显示,AngⅡ诱导的H9c2心肌细胞肥大模型组细胞面积较对照组显著增大,AngⅡ+不同浓度DIM给药组各组细胞面积均较AngⅡ刺激模型组减小(P<0.05),DIM中浓度(5μM)干预组与DIM高浓度(10μM)干预组之间无明显差异(P>0.05)。实时定量PCR结果显示,与Angκ模型组相比,DIM中浓度(5μM)干预组随着给药时间的延长,心肌细胞肥大标志物ANP、BNP与p-MHC的mRNA水平逐渐下降(P<0.05),并且DIM中浓度(5μM)干预组与DIM高浓度(10μM)干预组之间无明显差异(P>0.05)。选用中浓度(5gM)的DIM进行后续实验。采用western blot方法检测中浓度(5μM)的DIM对不同时间点(0,15,30,60min)Angκ诱导的H9c2心肌细胞中AMPKα、mTOR等心肌细胞肥大相关重要信号通路分子的磷酸化与总蛋白水平的影响,发现DIM能增加AMPKa的活性并抑制mTOR信号通路的活化(P<0.05)。AB术后8周,心脏超声与血流动力学检测结果显示预防与治疗实验中模型组小鼠较假手术组小鼠左心室室壁厚度增加、心室腔扩大,左心室收缩与舒张功能下降(P<0.05),而模型组小鼠中给药组心功能得到了改善(P<0.05)；预防与治疗实验中模型组小鼠HW/BW、HW/TL、心肌细胞横截面积以及左心室胶原容积分数均显著高于假手术组小鼠(P<0.05),而模型组小鼠中给药组较对照组上述指标均下降(P<0.05)；实时定量PCR结果显示,预防与治疗实验中模型组小鼠心肌组织中的ANP、BNP和β-MHC等心肌肥厚标志物以及TGF-β1TGF-β2、 collagen Iα、collagen Ⅲ和CTGF等心肌纤维化标志物的(?)nRNA表达水平均高于假手术组小鼠(P<0.05),反映收缩功能的a-MHC的mRNA表达水平较假手术组小鼠下降(P<0.05),而模型组中给药组小鼠上述指标均得到改善(P<0.05)。AB术后8周,对各组小鼠心肌组织中AMPKa和mTOR等心肌肥厚相关的重要信号通路分子的磷酸化与总蛋白表达水平进行检测,结果发现DIM能够进一步增强压力负荷所诱导的AMPKa,并可以抑制mTOR信号通路的激活(P<0.05)。AB术后4周,心脏超声与血流动力学检测结果显示AMPKa2基因敲除(KO)小鼠模型组较假手术组的左心室室壁厚度增加、心室腔扩大,左心室收缩与舒张功能下降(P<0.05),但KO模型组中给药组小鼠心功能未得到改善(P>0.05)；KO模型组小鼠较假手术组小鼠的HW/BW、LW/BW、HW/TL、心肌细胞横截面积以及左心室胶原容积分数均增大(P<0.05),而模型组中给药组与对照组之间均无统计学差异(P>0.05)；实时定量PCR结果显示,KO模型组小鼠较假手术组小鼠心肌组织中的ANP、BNP和P-MHC等心肌肥厚标志物以及TGF-β1、TGF-β2、collagen Iα、collagen Ⅲ和CTGF等心肌纤维化标志物的mRNA水平均升高,反映收缩功能的a-MHC的mRNA表达水平下降(P<0.05),而模型组中给药组与对照组之间上述指标均无统计学差异(P>0.05)。采用western blot方法检测各组小鼠心肌组织mTOR信号通路分子的磷酸化与总蛋白水平,结果发现DIM不能抑制AMPKa2缺失后mTOR信号通路的激活(P>0.05)。结论1.DIM可以抑制AngⅡ诱导的H9c2大鼠心肌细胞肥大；DIM增强AngⅡ诱导的AMPKa活性并抑制mTOR信号通路。2. DIM可以抑制压力负荷诱导的心肌肥厚与纤维化；并可以治疗已经出现的心肌肥厚与纤维化；DIM通过增强AMPKa活性,阻断mTOR信号通路抑制压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚。3.DIM不能抑制AMPKa2基因敲除小鼠的心肌肥厚与纤维化；AMPKa2基因缺失后,DIM丧失了其通过抑制mTOR信号通路发挥其抗压力负荷诱导的小鼠心肌肥厚的作用。