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背景:桦褐孔菌是一种非常珍贵的具备抗氧化、抗肿瘤、预防高血糖和抑炎等功能的药用真菌,本实验室已证明桦褐孔菌多糖(Inonotus obliquus polysaccharides,IOP)可抑制脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导的巨噬细胞表达和分泌IL-6、TNF-α等细胞因子。NLRP3炎症小体活化后可引起炎症相关细胞因子的过度表达以及分泌,介导炎症的发生。当NLRP3炎症小体的活化被抑制,其参与的炎症相关疾病可能被改善。IOP的抗炎作用机制是否与NLRP3炎症小体通路有关,至今未见研究报道。目的:利甩LPS诱导的体外炎症细胞模型，明确IOP的抗炎机制是否与NLRP3炎症小体信号通路有关。方法:本研究选择IOP作为研究对象。首先,复苏RAW264.7细胞,分为正常组和四种浓度的药物组,药物浓度分别为20、40、80、160μg/mL,培养24h后,使用MTT法检测不同浓度的IOP对RAW264.7细胞的药物毒性,判断IOP的药物安全性。其次,使用LPS(lμg/mL)刺激RAW264.7细胞构建的体外炎症细胞模型。将细胞分为正常组(Normal)、模型组(LPS)以及实验组(LPS+IOP),进行以下实验。第一部分,IOP(40μg/mL)与LPS共同作用于RAW264.7细胞6 h/24h后分别提取细胞内RNA以及蛋白质,通过RT-PCR法检测TNF-αmRNA的表达以及WB法检测Phospho-NF-κB-p65、COX2蛋白水平表达量,判断IOP对LPS处理的炎症细胞模型炎症分子及通路的影响。第二部分,使用IOP与LPS共同作用于RAW264.7细胞6 h/24 h后,分别提取细胞内RNA以及蛋白质,通过RT-PCR法检测NLRP3炎症小体各组分及其下游IL-18和IL-1βmRNA的表达。利用WB法检测NLRP3炎症小体各组分及其下游IL-18和IL-1β的蛋白水平表达量的改变。同时,收集IOP与LPS共同作用于RAW264.7细胞24h后的细胞上清液,用ELISA法对上清液中IL-18和IL-1β蛋白水平进行进一步验证检测。判断NLRP3在炎症发生和处理中的作用。最后,进行验证实验,使用WB法检测基因转染后 β-actin 以及 NLRP3siRNA1、NLRP3siRNA2、NLRP3siRNA3 的沉默效果。将细胞分为阴性对照组(NC-siRNA)、模型组(LPS)、实验组(LPS+IOP)、基因沉默后LPS处理组(LPS+siRNA)组以及基因沉默后LPS+IOP处理组(LPS+IOP+siRNA)组。NLRP3基因沉默24 h后,再通过LPS作用于基因沉默后的细胞24 h,提取蛋白,通过WB技术对NLRP3炎症小体组成蛋白的进行检测。结果:MIT结果表明不同浓度的IOP对RAW264.7细胞的存活率差异无统计学意义即对细胞不具有药物毒性。RT-PCR结果显示,Normal组与LPS组相比,细胞内TNF-αmRNA表达增加(P<0.05),LPS+IOP组TNF-αmRNA表达与LPS组相比,明显下降(P<0.05)。同时,与LPS组相比,LPS+IOP组细胞内NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-18 和 IL-1βmRNA 的表达明显下降(P<0.05)。WB 结果显示,相比于LPS组,LPS+IOP组细胞内COX2的蛋白表达明显减少(P<0.05);NF-κB-p65的磷酸化水平也明显被抑制(P<0.05)。此外,与Normal组相比,LPS组NLRP3炎症小体明显活化,其下游的促炎性细胞因子IL-18以及IL-1β的表达也明显升高,而IOP逆转了这种改变(P<0.05)。ELISA结果表明,LPS+IOP组促炎性细胞因子IL-18以及IL-1β在细胞培养上清液中的表达与LPS组相比有下降的趋势(P<0.05)。NLRP3基因沉默实验结果显示,与LPS组相比,LPS+siRNA组以及LPS+IOP+siRNA组明显抑制了 LPS引起的NLRP3、Caspase-1和ASC的表达升高(P<0.05),LPS+siRNA组与LPS+IOP+siRNA组相比没有统计学意义(P>0.05)。结论:IOP抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症,其机制可能是通过调节NF-κB核转录和NLRP3炎症小体的活化来实现。