【摘 要】
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防御素(Defensins)是一类富含二硫键的阳离子型多肽,广泛分布于动物体内,具有杀死细菌、真菌、病毒等微生物的作用,是先天免疫系统的一部分。本研究选用枯草芽孢杆菌细胞壁研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine Ruminal Epithelial Cells,ORECs)绵羊β-防御素-1(Sheep-β-Defesin-1,SBD-1)表达产生的影响及其参与的信号转导通路。为探究枯草芽
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防御素(Defensins)是一类富含二硫键的阳离子型多肽,广泛分布于动物体内,具有杀死细菌、真菌、病毒等微生物的作用,是先天免疫系统的一部分。本研究选用枯草芽孢杆菌细胞壁研究其对体外培养的绵羊瘤胃上皮细胞(Ovine Ruminal Epithelial Cells,ORECs)绵羊β-防御素-1(Sheep-β-Defesin-1,SBD-1)表达产生的影响及其参与的信号转导通路。为探究枯草芽孢杆菌细胞壁能否对ORECs SBD-1的表达产生影响,本试验先利用反复冻融和超声波破碎相结合的方法破碎枯草芽孢杆菌收集其细胞壁并对其成分进行鉴定,将不同浓度(0、25、50、100、200、400μg·m L-1)的枯草芽孢杆菌细胞壁与ORECs共培养8 h后,采用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)和酶联免疫吸附测定(ELISA)检测方法筛选出枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度,再用最佳刺激浓度对ORECs进行不同时间(0、2、4、8、12、24 h)的刺激筛选出枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达的最佳刺激时间。结果显示:枯草芽孢杆菌细胞壁成功制备,其刺激ORECs诱导SBD-1表达的最佳刺激浓度为50μg·m L-1,最佳刺激时间为12 h。选用枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达的最佳刺激条件刺激ORECs进行信号通路的初步研究。先分别采用蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB)和RT-q PCR技术检测通路因子(TLR-2、My D88、NF-κB、p38、JNK、ERK1/2)刺激前后蛋白和m RNA的表达变化,再使用通路抑制剂分别阻断NF-κB、p38、JNK、ERK1/2后检测其对诱导SBD-1的影响。结果显示:最佳条件刺激ORECs后TLR-2、My D88、NF-κB、p38、JNK、ERK1/2的m RNA和蛋白的表达均升高,使用通路抑制剂阻断各个信号通路后SBD-1 m RNA表达量均下降,且添加JNK和NF-κB抑制剂组下降幅度最大。综上,TLR-2-My D88-NF-κB和TLR-2-My D88-MAPK参与枯草芽孢杆菌细胞壁诱导SBD-1表达。
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