拟南芥突变体edt1根系发育的分子机制及pqt24-1耐百草枯机制研究

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在我们的前期工作中筛选到一个耐旱突变体,命名为edt1 (enhanced drought tolerance 1) 。该突变体具有比野生型拟南芥更发达的根系,包括更长的主根和更多的侧根。这些表型的获得都是源于HD-ZIP转录因子家族第四亚家族的AtHDG11基因的过量表达。edtI很可能有其特有的根系发育模式,但是具体的分子机制仍然不清楚。通过对该突变体的根系转录组分析,我们发现细胞壁相关基因、氧化胁迫响应基因、氧自由基清除基因和感受渗透压变化及响应的基因被显著富集,这些基因在根系的发育中发挥着不同的作用。通过相邻生长点的转录组比较分析,发现突变体中和多种主要营养物质吸收相关的基因、氧自由基清除基因及细胞壁相关基因得到及时的显著上调,加快了根系发育的进程。我们对在突变体中发生显著上调的细胞壁松弛相关基因,包括膨胀素、木葡聚糖转移酶、伸展蛋白、果胶水解酶、果胶甲酯化抑制子和内切β-1,4-D-葡聚糖酶,进行了进一步研究。细胞壁松弛因子的高表达有利于提高细胞壁的机械柔性,从而使得细胞更易于延伸和生长。通过对启动子序列的分析,我们发现显著上调的细胞壁松弛基因中很大比例的基因启动子区含有与HD结构域结合的homeobox,尤其是AAATTAAA序列。通过酵母单杂交实验发现HDG11可以与这些homeobox以不同的亲和力结合,其中与AAATTAAA序列亲和性最高。通过染色体免疫沉淀实验(ChIP)进一步证实在体内HDG11也可以与含有这些顺式作用元件的启动子区域结合。过量表达上调最显著的膨胀素基因EXPA5,可以导致拟南芥主根变长、根系延伸得更快,通过显微观察发现这些性状是由伸长区细胞变长导致的。以上实验结果证明了HDG11可以直接调控细胞壁松弛因子的表达从而改变根系细胞壁的柔性,使之易于生长,并最终导致突变体根系更加发达,这对于突变体耐旱性状是一个重要贡献。百草枯(paraquat, PQ)是世界上使用最广泛的除草剂之一,同时也是一个强氧化剂,在实验中经常被用作产生氧化胁迫。我们从一个含有5,5000个独立株系的拟南芥激活突变体库中筛选得到一个在含有2μM百草枯的MS培养基上可以正常生长的突变体,命名为pqt24-1。通过交错式热不对称PCR (Tail-PCR)鉴定出该突变体的T-DNA的插入位点在Atlg66950的第十三个外显子。Atlg66950编码一个ABC转运蛋白AtPDR11。通过RT-PCR可以检测到该插入破坏了AtPDR11基因的转录。AtPDR11蛋白含有跨膜结构域,蛋白定位实验结果也表明该蛋白定位在质膜上。通过同位素吸收实验证实AtPDR11是百草枯运入植物细胞的载体蛋白,这是首次在植物中发现百草枯的转运蛋白。进一步实验发现AtPDR11可以被百草枯和其他非生物胁迫,如过氧化氢、盐、干旱和重金属诱导表达。而这些胁迫的共同点都是都可以产生氧化胁迫,显示AtPDR11的表达可以被氧化胁迫信号上调,是氧化胁迫的响应因子。综上,我们的实验结果表明拟南芥突变体pqt2-1对于百草枯的耐受是由植物细胞对百草枯吸收降低而导致的,百草枯是AtPDR11的底物。
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