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丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)和人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)的传播途径十分相似,约30%的HIV感染者合并HCV感染。中国和欧洲静脉药瘾的HIV感染者中,合并感染HCV甚至可高达90%[1]。HCV患者合并感染HIV将加速丙型肝炎病程进展,同时降低抗HCV疗效。近年较多的循证医学证据显示,对合并感染患者针对HIV进行严格的高效抗逆转录病毒治疗(Highly active antiretroviral therapy,HAART)不能有效的改善这些情况,同时HCV病程加速也与CD4+T淋巴细胞数量下降无明显关联。有研究证实,HIV合并感染可能导致患者体内HCV准种分布特征改变,但HCV载量及准种复杂度与CD4+T淋巴细胞数量无关[2,3]。这些证据都提示,HIV对HCV的影响可能存在免疫系统介导之外的其他途径。有研究证实HCV、HIV可以共感染同一肝细胞,进而可能导致两种病毒在同一细胞内发生相互作用[4]。HCV、HIV均为RNA病毒,且传播途径相似;而DDX3(DEAD-box解旋酶3)在人体细胞内与RNA的复制过程关系密切,已有的研究证实DDX3可与HCV Core蛋白结合促进HCV复制[5,6]。同时也有学者发现HIV Tat蛋白可以在淋巴细胞内诱导DDX3高表达[7];另一方面,HIV Rev蛋白可与DDX3结合在核膜上形成复合体从而影响胞浆内DDX3的水平[8]。本实验正是基于已有的研究成果,通过体外培养人肝癌细胞Huh7细胞株,并以此细胞株为基础,利用HCV复制质粒p CDNA3.1-JFH1构建HCV细胞复制模型。构建Tat、Rev蛋白及DDX3解旋酶相关表达载体,通过HCV细胞复制模型,探讨Tat、Rev蛋白与DDX3解旋酶相互作用对HCV复制的影响。运用实时荧光定量q PCR、Western-blot等技术进行分析研究,从而阐明Tat、Rev蛋白与DDX3解旋酶相互作用对HCV复制的影响及其机制。方法:1.查询NCBI获得Tat蛋白、Rev蛋白及DDX3的基因表达序列,并合成相关基因序列,分别构建以荧光蛋白标记的HIV Tat表达载体pcDNA3.1-Tat-Flag-EGF、荧光蛋白标记的HIV Rev表达载体pCDNA3.1-Rev-Flag-mCherry和荧光蛋白标记的DDX3表达载体p CDNA3.1-DDX3-YFP-Flag,相关表达载体进行PCR鉴定及相关序列测定,并分别转染入Huh7细胞中,进行Western-blot检测相关目的基因的表达。2.瞬时转染p CDNA3.1-JFH1重组表达载体进入Huh7细胞中,设立为对照组。将p CDNA3.1-JFH1和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag瞬时共转染入Huh7细胞中,设立为实验组。转染48h后,提取总RNA进行q PCR检测HCV RNA的表达情况;提取总蛋白进行Western-blot检测DDX3的表达。3.瞬时转染p CDNA3.1-JFH1重组表达载体进入Huh7细胞中,设立为对照组。分别设立三组实验组:a、pCDNA3.1-JFH1、pcDNA3.1-Tat-Flag-EGF和p CDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重组质粒瞬时共转染入Huh7细胞中;b、pCDNA3.1-JFH1、p CDNA3.1-Rev-Flag-m Cherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重组质粒瞬时共转染入Huh7细胞中;b、p CDNA3.1-JFH1、pc DNA3.1-Tat-Flag-EGF、p CDNA3.1-Rev-Flag-m Cherry和pCDNA3.1-DDX3-YFP-Flag重组质粒瞬时共转染入Huh7细胞中。转染48h后,分别提取各组总RNA进行qPCR检测HCV RNA的表达情况;分别提取各组总蛋白Western blot检测Tat蛋白、Rev蛋白及DDX3的表达。结果:1.通过PCR鉴定、序列测定以及Western-blot检测证实成功构建了Tat蛋白、Rev蛋白和DDX3的表达载体,并能在Huh7细胞株中表达。2.通过qPCR测定转染48h后比较DDX3对HCV RNA复制的影响,证实DDX3可以促进HCV RNA的复制(P=0.03)。3.通过q PCR测定转染48h后比较发现,Tat+DDX3对HCV RNA复制的影响无显著差异(t=1.392,p>0.05);而Rev+DDX3对HCV RNA复制的影响有显著差异(t=8.778,p<0.01),表明Rev+DDX3能够抑制HCV RNA的复制。4.通过q PCR测定转染48h后比较发现,Tat+Rev+DDX3对HCV RNA复制的影响有显著差异(t=﹣3.613,p<0.05),表明Tat+Rev+DDX3能够促进HCV RNA的复制