基于核酸适体技术的丙型肝炎病毒核心抗原检测方法研究

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丙型病毒性肝炎是由丙型肝炎病毒(HCV)引起的一种传染性疾病,主要通过血液传染。全球大约有3%的人感染了HCV。HCV感染可导致严重的肝脏疾病,如慢性肝炎、肝硬化乃至肝癌。HCV基因组为单股正链RNA,编码一个长约3010个残基的多聚蛋白。目前世界范围内尚未开发出有效的HCV疫苗。HCV核心蛋白(core蛋白)可通过影响细胞周期,介导凋亡,影响染色体损伤及基因突变和转录因子及线粒体等多个环节而导致肝细胞发生恶性转化,从而形成恶性肿瘤。HCV core蛋白在HCV感染后1周就会出现在血液中,是HCV感染早期的主要标志物之一,已成为HCV感染的一项重要检测指标。现有的抗-HCV抗体检测存在检测窗口期长、检测试剂质量不稳定等不足;PCR检测HCV RNA,由于检测方法操作复杂、仪器昂贵、容易交叉污染而存在一定局限性,不适合血液或血制品筛查,也难以在普通基层医院推广使用。因此探索开发HCV早期诊断的新方法具有重要意义。核酸适体(Aptamer)是运用指数富集配体系统进化(SELEX)从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高度特异性结合靶标分子的单链寡核苷酸,具有亲和力高,特异性强,易体外合成与修饰等特点。我们运用基因克隆技术把HCV core基因片段插入载体pLM1中,成功构建出HCV core蛋白重组表达载体pLM1-APJFH1-core,经过诱导表达、Ni-NTA纯化柱纯化得到大量目的蛋白。通过SELEX技术,以纯化的HCV core蛋白为靶分子,经过6个循环的筛选,最终从文库中筛选出了特异性结合HCV core蛋白的核酸适体,并运用荧光信号检测方法等进行特异性表征。基于筛选出来的HCV core蛋白核酸适体,我们建立了一种新型的酶联寡核苷酸检测方法—ELONA(Enzyme-linkedoligonucleotide assay)。运用ELONA方法实现了对重组HCV core蛋白和临床HCV病人血清中核心蛋白的检测。ELONA方法提高了检测灵敏度,缩短了检测窗口期,有望实现普通人群中HCV感染患者早期诊断和临床筛查,进而为其他疾病的早期诊断、临床筛查提供指导。
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