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研究背景:结直肠癌（Colorectal cancer,CRC）是临床最常见的消化系统恶性肿瘤,具有较高的发病率与死亡率,严重威胁全球人类健康。尽管目前结直肠癌的诊治技术不断进步,但仍有大量患者可能出现不良反应、复发或转移,因此寻找结直肠癌新疗法意义重大。黄芪多糖（Astragalus polysaccharides,APS）是祖国传统中药材黄芪的重要活性成分,具有广谱的抗肿瘤效果,近些年用于抗肿瘤尤其是结直肠癌的治疗日益受到人们的重视。我们的前期研究表明,APS对结直肠癌荷瘤小鼠的肿瘤生长具有显著的抑制作用,但其作用机制仍有待进一步研究。目的:基于PI3K/Akt/mTOR信号通路探讨APS对结直肠癌自噬的影响研究。方法:1.CCK-8检测各浓度APS对人结直肠癌细胞HCT-116增殖的影响:设置5组,包括对照组及APS梯度组（0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml）。干预12h、24h、48h后测OD值。2.MDC法检测APS对HCT-116细胞自噬的影响:设置3组,包括对照组、APS组（1mg/ml）及APS+3-ma（2m M）组。干预24h,荧光显微镜下观察、拍照、分析。3.CCK-8检测APS对HCT-116细胞增殖的影响与自噬的关系:设置4组,包括对照组,APS组（1mg/ml）,3-ma（2m M）组,APS+3-ma组。干预24h后,测各组OD值。4.细胞划痕实验检测APS对HCT-116细胞迁移的影响及其与细胞自噬的关系:设置4组,包括对照组、APS组（1mg/ml）、3-ma（2m M）组以及APS+3-ma组。当细胞生长至90%汇合度时,划痕,置于倒置显微镜下观察拍照并测距。干预24h后,置于显微镜拍照,测距并计算。5.Western Blot法检测APS对HCT-116细胞自噬及PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的影响:设置4组,包括对照组,APS组（1mg/ml）,3-ma（2m M）组,APS+3-ma组。干预24h后,提取蛋白,测定各组LC3B、p62蛋白表达水平。6.Western Blot法检测APS对HCT-116细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的影响:设置4组,包括对照组,APS（1mg/ml）组,740Y-P（10u M）组,APS+740Y-P组。干预24h后,提取蛋白,检测各组p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt及mTOR蛋白表达情况。7.结直肠癌荷瘤小鼠肿瘤组织的获取:课题组前期留存的肿瘤组织蜡块和冰冻肿瘤组织标本。选取的肿瘤组织的干预分组包括对照组（生理盐水,20m L/kg）、APS L组（APS,50mg/kg）、APS H组（APS,250mg/kg）。8.免疫组化法（IHC）检测小鼠肿瘤组织p62蛋白表达情况:使用小鼠肿瘤组织蜡块制作结直肠癌肿瘤组织切片,使用免疫组化试剂盒进行检测。9.Western Blot法检测小鼠肿瘤组织中自噬和PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白的表达情况:裂解提取冰冻的小鼠肿瘤组织蛋白,检测p62、LC3B、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、PI3K、Akt及mTOR蛋白表达情况。结果:1.CCK-8结果显示,与对照组相比,不同浓度的APS（0.25mg/ml、0.5mg/ml、0.75mg/ml、1mg/ml）处理HCT-116细胞12h、24h、48h后,除0.25mg/ml APS在干预12h后未显示出明显的抑制效果外（P＞0.05）,其余各组细胞增殖均受到了抑制（P＜0.05）,且抑制作用呈浓度和时间依赖性。2.MDC染色结果显示,与对照组相比,APS组细胞内的绿色点状荧光强度及数量明显增加。而在联用自噬抑制剂3-ma后,细胞内的绿色点状荧光强度较单用APS相比减弱。3.CCK-8结果显示,与对照组相比,1mg/ml APS干预HCT-116细胞24h后,细胞增殖得到了抑制（P＜0.05）,而这种抑制作用可以被自噬抑制剂3-ma所减弱（P＜0.05）。4.细胞划痕实验结果显示,干预24h后,与对照组相比,APS组细胞迁移率显著降低（P＜0.05）;与APS组相比,APS+3-ma组细胞迁移率增高（P＜0.05）。5.Western Blot结果显示,与对照组相比,使用APS干预后,HCT-116细胞及小鼠肿瘤组织中自噬相关蛋白LC3BⅡ/Ⅰ的表达比增高（P＜0.05）,而p62蛋白表达水平则降低（P＜0.05）;APS干预后,HCT-116细胞及小鼠肿瘤组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt及p-mTOR/mTOR的表达比降低（P＜0.05）,而在联用PI3K激动剂740Y-P（10u M）后,APS对HCT-116细胞PI3K/Akt/mTOR信号通路的相关蛋白表达的抑制作用较单用APS减弱（P＜0.05）。6.免疫组化结果显示,与对照组相比,APS组肿瘤组织的p62蛋白表达减少,且呈剂量依赖性。结论:APS可以诱导结直肠癌细胞HCT-116和结直肠癌小鼠肿瘤自噬,且可以通过诱导自噬抑制HCT-116细胞的增殖和迁移,其机制可能与抑制PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。