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目的:通过对凉粉草质量进行系统的研究,为建立其安全、有效、可靠的质量控制标准体系提供科学依据。采用大孔树脂对凉粉草的总黄酮提取纯化工艺和抗氧化性进行研究,并通过凉粉草提取物对前脂肪细胞3T3-L1的作用初步评价凉粉草体外降脂能力,为科学开发利用凉粉草资源提供依据。方法:1.凉粉草质量标准研究采用显微鉴别法对凉粉草粉末进行定性鉴别;采用薄层色谱法对熊果酸、齐墩果酸进行定性鉴别;采用分光光度计法对总黄酮、总酚酸和总糖含量测定方法进行研究,对凉粉草中咖啡酸、迷迭香酸、紫云英苷进行HPLC含量测定,并采用主成分分析对不同产地凉粉草含量进行分析;利用高效液相色谱-二级阵列管检测器建立不同产地凉粉草的指纹图谱,并采用聚类分析和主成分分析法评价其质量。2.分子鉴定研究用5条通用条形码序列(核基因ITSI、ITS2序列和叶绿体psbA-trnH、rbcL、matK序列)筛选出合适的序列用于区别凉粉草及其混伪品。3.凉粉草的总黄酮提取纯化工艺和抗氧化性研究利用单因素法-正交实验确定凉粉草中总黄酮的提取方法,并从6种型号的大孔树脂中筛选最优的型号,对最优型号的大孔树脂的纯化方法进行优化,对其纯化产物进行抗氧化能力测定。4.凉粉草体外降脂能力初步研究体外建立3T3-L1前脂肪细胞模型,用鸡尾酒法诱导其分化,药物组细胞分化过程中采用不同浓度凉粉草提取物进行干预,对空白组、对照组和高、中、低给药组细胞进行油红O染色,测定细胞间脂质含量,提取细胞总蛋白,采用Western blot测定总蛋白中过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor,PPARy)、CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)、长链脂肪酸羧化酶(acyl-CoA synthetase long-chain family member 1,ACS-L 1)、胆固醇调节元件结合蛋白(Sterol-regulatory element binding proteins,SREBPS)、AMP 依赖的蛋白激酶(Adenosine5’-monophosphate(AMP)-activated protein kinase,AMPK)蛋白表达量。结果:1.质量研究:凉粉草显微特征明显;薄层鉴别供试品色谱中,在与各对照药材色谱和各对照品色谱相应的位置上,均显相同颜色的斑点,薄层色谱斑点清晰、分离度好;水分在6.14%～9.45%范围内;浸出物在20.82%～30.69%范围内。测定凉粉草中咖啡酸、迷迭香酸、紫云英苷、总黄酮、总酚酸和总糖的含量,建立的含量测定方法重复性好、准确度良好,经过主成分分析,可以提取2个主成分,累计贡献率87.979%,其综合评价函数为F=0.5406F1+0.3392F2,总糖、总酚酸和总黄酮对于凉粉草的质量评价有重要贡献。建立凉粉草的指纹图谱,标定9个共有峰。不同产地的凉粉草药材有不同的化学特征,本研究将凉粉草样品聚类分为4类;提取出3个主成分,累积贡献达到81.073%;20批样品的相似度在0.829-0.997之间;三种分析方法的结果相互印证。2.分子鉴定研究:matK序列扩增成功率低;ITS1序列存在单一变异位点且测序成功率低;ITS2、rbcL和psbA-trnH三个序列无变异位点,序列扩增成功率、测序成功率高,序列长度在233bp-671bp,从系统聚类树上得出ITS2序列可以将凉粉草与其他三种混伪品区分开,而rbcL和psbA-trnH序列在区分时存在一定的混淆。3.提取纯化工艺研究:乙醇浓度50%物料比1:50、提取时间1.5h,提取率为13.31%。X-5型大孔树脂最适合纯化仙草总黄酮,吸附量为12.73mg/g,解析率为58.84%。纯化工艺为浓度0.3mg/mL,pH=2-4的粗提物静态吸附24h;以2BV/h的速度,10%-40%乙醇进行梯度洗脱。经过X-5树脂纯化后得到的仙草总黄酮对DPPH自由基清除能力增强,仙草粗提物的半抑制浓度为80μg/mL,纯化后的半抑制浓度为21μg/mL,有较好的抗氧化活性。4.体外降脂作用研究:凉粉草可以显著降低3T3-L1细胞中脂质含量,在分化过程中能显著降低给药组PPARγ、C/EBPα、ACS-L1的蛋白表达量,提高AMPK的蛋白表达量,对SREBP蛋白的表达量无明显影响,得出结论:凉粉草提取物可以干扰3T3-L1分化成脂过程中脂肪的生成和累积量,可能通过抑制脂肪酸合成的途径实现,暂时无法证明与固醇类合成有关。结论:本研究建立的质量控制方法可以用于凉粉草的质量控制标准提升,建立的物质纯化方法可以用于凉粉草物质基础研究,凉粉草降脂作用体外研究结果可以作为体内实验的理论依据。