肿瘤严重影响人们的生活质量,危及人们的生命安全。肿瘤的生物学研究有助于揭示肿瘤发生发展的规律,为肿瘤的预防、诊断及治疗提供理论支持。电化学生物传感技术具有高灵敏度、高选择性的特点,可在分子及细胞水平研究生物体系的电子传递及其相关过程,为肿瘤的生物学研究提供新方法。本论文基于电化学生物传感技术,开展了肿瘤生物学的一些基础和应用研究。主要内容如下:1.乙酰化对p53羧基末端结构域DNA结合活性影响的研究p53蛋白是一种重要的转录因子,它通过与DNA结合发挥肿瘤抑制作用,而乙酰化通过调节蛋白的DNA结合活性,调节p53蛋白活性。作者以电极表面乙酰化程度不同的p53羧基末端结构域(CTD)为对象,研究了乙酰化对其DNA结合活性的影响。结果表明不同乙酰化水平的多肽,与DNA的结合能力不同,其捕获二茂铁标记的DNA分子探针能力也有所差别,因而根据二茂铁信号的强弱,即可获知乙酰化对CTDDNA结合活性的影响。进一步研究发现,随着CTD乙酰化水平的升高,p53 CTD DNA结合能力逐渐增强。此外,本工作所设计的研究方法简单快速,为蛋白质翻译后修饰作用机理的研究提供了新思路。2.胶原-DNA复合物的界面组装及基质金属蛋白酶-2活性的检测应用基质金属蛋白酶-2通过降解细胞外基质,促进肿瘤的侵袭和转移。作者通过在电极表面构建胶原-DNA复合物,从而提出了检测基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性的新方法。胶原和DNA具有结构上的相似性,因而可在电极表面以DNA为模板构建胶原-DNA的复合物。作者以其中的胶原为底物,设计了一种检测MMP-2活性的新型传感器,其原理是,当胶原经MMP-2降解后,电极表面的空间位阻减小,电化学信号分子[Fe(CN)6]3/4-与电极表面的电子传递增强,因此该电化学信号的变化即可反映MMP-2的活性。该方法简便易行,可线性检测0.1?1μg/mL MMP-2。此外,利用胶原-DNA复合物形成过程中对靶蛋白的空间阻隔作用,还可实现蛋白质在电极表面的组装为蛋白分析提供新平台。3.含CUB结构域蛋白在细胞粘附中作用的研究细胞粘附在肿瘤的侵袭和转移中起着非常重要的作用,作者以静电纺丝技术形成的10%聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)静电膜在电极表面3D培养细胞,并根据细胞发生粘附前后导电能力的差异研究了含CUB结构域蛋白(CDCP1)在肿瘤细胞粘附中的作用。结果表明,高表达CDCP1的细胞失去粘附表型,可在电极表面进行3D培养。其中,细胞与细胞之间的间隙连接使得细胞在电场中导电性大大增强。但当引入CDCP1的抗体时,细胞粘附性增强,其在电极表面形成了阻碍电子传递的细胞层,细胞导电能力减弱。因此,根据加入抗体前后细胞导电能力的差异即可获知CDCP1在细胞粘附中的作用。该方法为肿瘤细胞粘附过程中相关分子的研究提供了新思路。4.基于多肽-磷脂酰丝氨酸相互作用对细胞凋亡的研究肿瘤细胞的恶性增殖是细胞凋亡受抑制的结果,细胞凋亡的障碍与肿瘤的发生、发展具有密切关系。作者以一段简单多肽代替膜联蛋白V(Annexin V)作为分子识别元件,利用凋亡细胞外表面高表达磷脂酰丝氨酸(PS)的特点,实现了对凋亡细胞的灵敏测定。电极表面的多肽能够特异性识别凋亡细胞表面的PS,并与之结合将凋亡细胞捕获到电极表面,这大大增加了电极表面的空间位阻,同时也屏蔽了电极表面多肽所带有的电荷,因而影响了电化学信号分子[Fe(CN)6]3-/4-与电极表面的电子传递,并最终导致了电化学响应的改变,该变化即可用于指示凋亡细胞的数量。该方法的灵敏度度可媲美荧光法和比色法,但操作更为简单,成本也更为低廉,因而有望广泛应用于细胞凋亡相关研究领域。5.基于iRGD透膜作用对细胞内抗癌药物阿霉素浓度的测定化疗是目前肿瘤治疗的主要手段之一,药物对肿瘤细胞的杀伤作用,依赖于进入细胞内的药物浓度。作者以iRGD为转染试剂,将电子传递载体DNA导入细胞内,实现了对细胞内阿霉素浓度变化的检测。iRGD能够增强细胞膜通透性,因而能够促进电极表面的DNA进入细胞内部,实现细胞在界面的固定,与此同时,细胞内的阿霉素又可以嵌入DNA链,其氧化还原反应中的电子沿着DNA链传递到电极表面,因此细胞内物质信息就传导到了细胞外,实现了细胞内外信号的连通。该方法条件温和,既保证了细胞活性,又为化疗过程中细胞内有效药物浓度的测定提供了新方法,同时也为细胞内物质的研究提供了新方法。6.基于病毒蛋白-DNA纳米复合物对细胞内pH值变化的监测细胞内pH(pHi)对细胞功能有着重要的调节作用,其细微的变化即可影响细胞的代谢和信号传导等功能,从而对生物体产生很大的影响。作者设计了一种基于豇豆退绿斑驳病毒外壳蛋白-DNA(CCMV CPs-DNA)纳米管的新型电化学细胞内pH传感器,用于指示细胞内pH值的变化。该传感器的pH敏感性源自电极表面CPs-DNA复合物中嵌入的亚甲基蓝分子(MB),其峰电位具有pH敏感性,即随着pH值的不同其峰电位发生偏移。同时,由于该病毒外壳蛋白末端具有多聚精氨酸结构域,这使得该传感器还具有跨膜活性,因此,在病毒外壳蛋白的协助下,该pH传感器无需借助载体即可进入细胞内部,并通过结合细胞内MB,感应细胞内pH值的变化。作者所研制的细胞内pH传感器具有较广的pH值响应范围,因而为生理和病理反应中pH值变化的测定奠定了基础。