论文部分内容阅读
枯草芽孢杆菌表达系统具有生物安全性高、遗传背景清晰、蛋白分泌能力强等突出特点,广泛地应用于生产和表达各种外源蛋白。本研究旨在利用无痕敲除技术和胞外蛋白谱构建无抗性标记的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）表达宿主、采用转录组学技术和信号肽库筛选挖掘最优表达元件以及分析Sec分泌途径中折叠相关基因功能的研究,建立具有应用潜力的枯草芽孢杆菌高效表达系统。本文先通过温敏型质粒pKS2无痕敲除体系失活了B.subtilis ATCC 6051的八种蛋白酶编码基因（nprE、nprB、aprE、mpr、bpf、epr、vpr、wprA）,一个芽孢形成因子F编码基因spollAC和surfactin合成酶编码基因srfAC,成功构建了B.subtilis无抗性标记、不产孢子且副产物少的宿主;并以B.subtilis 168为参照做相对应的研究。将茂原链霉菌（Streptomyces mobaraensis）来源的转谷氨酰胺酶酶原（proMTG）和嗜热地芽孢杆菌（Geobacillus kaustophilus）来源的耐热半乳糖苷酶（BgaB）验证表达宿主的重组蛋白可行性,菌株B.subtilis ATCC6051?10（?spollAC、?srfAC、?aprE、?nprE、?nprB、?epr、?mpr、?bpr、?vpr、?wprA）对proMTG和BgaB的重组表达效果最好;且建立了该宿主的胞外分泌蛋白谱图。基于对数生长后期的三株模式芽孢杆菌（B.subtilis 168、地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis ATCC14580、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium DSM319）的RNA-Seq数据分析,以BgaB为报告蛋白构建了启动子筛选质粒,先将三株芽孢杆菌中高表达的前十个基因的启动子片段供筛选,获得了31个启动子侯选库;其中两个启动子(PglvA和Phag)在对数生长后期BgaB酶活高于传统强启动子P43。将三株芽孢杆菌表达基因通过同源基因家族分析（Orthomcl）和RPKM值排名关系数值,将前十个共同高表达同源基因的启动子片段供筛选,得到30个启动子侯选库;筛选得到五个启动子的BgaB酶活高于P43,其中启动子PydzA（B.subtilis 168）酶活最高为44.3 U/mL,是P43的3.41倍。将上述七个强启动子表达proMTG和来自长野芽孢杆菌（Bacillus naganoensis）的普鲁兰酶（PUL）,结果表明启动子PsodA（B.naganoensis DSM319）表达proMTG酶活最高为82.6 U/mL,是P43的1.49倍,启动子PspoVG（B.Subtilis 168）表达PUL酶活最高为328.4 U/mL,是P43的1.47倍。将173种Sec信号肽库构建信号肽高通量筛选载体,以BgaB为目标蛋白进行筛选,共得到了48种有效分泌的信号肽,其中细胞分离酶LytF信号肽的分泌效果最显著。将信号肽库进一步用于proMTG和来自嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）的麦芽糖型淀粉酶AmyM的信号肽筛选研究,proMTG获得30种有效分泌的信号肽,AmyM获得27种有效分泌的信号肽,都是在AprE的引导分泌效果最好。结果证实了信号肽对不同蛋白的分泌效率有着明显的差异,需对目标蛋白进行特异性筛选。将前期筛选的最佳表达宿主6051?10、最强启动子PsodA和最优分泌信号肽SaprE重组表达proMTG,重组菌M5-1在摇瓶培养48 h达到酶活最高值126.55 U/mL;经亲和层析纯化后的酶活为53.06 U/mg,比同期研究报道酶活高1.74倍。5 L发酵罐中进行培养,54 h得到最高酶活855.54 U/mL,是摇瓶的6.76倍;经亲和层析纯化后的酶活为171.98U/mg,是摇瓶的3.24倍。结果表明该表达系统成功实现了proMTG的高效重组分泌表达,具有较好的应用潜力。以6051?10为出发株,构建了四株Sec分泌途径中折叠相关的prsA、htrA、htrB基因缺失的工程菌和三株整合不同芽孢杆菌的PrsA蛋白的基因工程菌株。应用于重组表达proMTG,结果表明失活prsA的工程菌的酶活最低,只有重组菌M5-1的12.5%,整合及共表达PrsA蛋白均在一定程度上改善了失活自身PrsA蛋白的B.subtilis对proMTG的重组分泌表达。以6051?10为宿主,构建了三株共表达不同芽孢杆菌的PrsA蛋白和proMTG的重组菌,结果表明过表达PrsA均促进了proMTG的分泌,其中来自B.megaterium的PrsA蛋白叠加效果最好。