论文部分内容阅读
第一部分目的采用简易的方法制备早产儿视网膜病的可量化动物模型。方法新生鼠仔44只称重随机分为两组,实验组于出生后7d置于75±1%氧箱内饲养5d后回到正常空气饲养5d,对照组于常氧环境饲养。视网膜铺片(ADP酶法)了解视网膜血管的改变,组织切片HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数,免疫组化法观察视网膜各层血管内皮生长因子(VEGF)的表达。结果持续高浓度氧使鼠仔视网膜血管收缩变窄甚至闭塞,视网膜中央部大片无灌溉区,相对缺氧使视网膜大血管明显扩张、迂曲,大量结构异常的新生血管形成。实验组与对照组平均每个切面突破视网膜内界膜的内皮细胞核数分别为33.85±0.7452;2.60±0.6806。两者比较差异有显著性意义( P < 0. 01) ;对照组VEGF染色较实验组减弱。结论该模型可重复性强,稳定性高,可定量研究。是研究ROP新生血管发生机制及相关治疗的合适模型。第二部分目的测定正常鼠及ROP时视网膜缺氧诱导因1α(HIF-1α)和VEGF的表达及其对血管新生的调控作用,为阐明ROP的发病机制提供动物实验依据。方法新生Wistar鼠仔64只称重随机均分为两组,实验组于出生后7d置于75±1%氧箱内饲养5d后回到正常空气饲养5d,对照组于常氧环境饲养。HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数;免疫组化法观察视网膜各层VEGF和HIF-1α的表达及三者相关性。结果实验组,对照组平均每个切面突破视网膜内界膜的内皮细胞核数分别为32.80±0.7678;2.75±0.7164,两者比较差异有显著性( P < 0. 01) ;免疫组化结果显示:对照组:VEGF在毛细血管内皮细胞胞浆中有少许表达,HIF-1α无表达。实验组:VEGF在毛细血管内皮细胞胞浆和胞核中表达明显增加,HIF-1α在胞核中有表达。视网膜新生血管芽细胞核数与视网膜组织VEGF含量和HIF-1α含量均呈正相关,相关系数分别为r=0.791,p<0.01;r=0.951,p<0.01.视网膜组织中HIF-1α与VEGF含量呈正相关(r=0.99,p<0.01).结论视网膜局部缺氧,导致HIF-1α表达,VEGF表达增加,新生血管异常发育,出现ROP的病理改变,突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核明显增加,三者呈正相关。第三部分目的建立成功的ROP模型,玻璃体腔注射HIF-1α反义寡核苷酸了解其对视网膜新生血管和VEGF表达的抑制作用。方法7日龄清洁级Wistar早产鼠仔80只称重随机均分为两组,实验组于出生后7d置于75±1%氧箱内饲养5d后回到正常空气饲养5d,对照组于常氧环境饲养。两组分别从日龄12、14、16d开始予左眼玻璃体腔注射HIF-1α反义寡核苷酸。右眼作为自身对照。一部分实验组左眼注入生理盐水。即得到五组标本:分别为正常眼(A) ,正常眼+反义HIF(A1),ROP眼(B),ROP+反义HIF(B1),ROP眼+生理盐水(B2)。实验组和对照组各取新生鼠15只,鼠龄分别为12、14、17d,各5只(每个时间点有一只左眼注射生理盐水),进行视网膜铺片。以观察五种视网膜血管发育及增生情况,每组各取10只新生鼠,均于生后第17d颈椎脱臼处死。摘除眼球,组织切片HE染色计数五组标本突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数,免疫组化法观察五组标本视网膜各层VEGF和HIF-1α蛋白水平的表达。实验组和对照组各取新生鼠15只,鼠龄分别为12、14、17d,各5只(每个时间点有一只左眼注射生理盐水)半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)观察5组不同时间点VEGF和HIF-1αmRNA的变化及其对应关系。结果视网膜铺片显示A组: 12d见少量无灌注区,周边血管结构清晰, 14d无灌注区消失,血管形态基本正常, 17d血管形态全部正常。A1组:12,14,17d视网膜血管形态和A组基本相同。B组:12d视网膜血管收缩变窄甚至闭塞,视网膜中央部有大片无灌注区, 14d新生血管开始形成, 17d视网膜大血管明显扩张、迂曲,大量新生血管形成。B1组17d视网膜大血管形态与A组同日龄相似,新生血管较B组明显减少。B2组的铺片结果和B组近似。组织切片HE染色计数突破视网膜内界膜的血管内皮细胞核数A,A1,B,B1,B2组分别为2.75±0.7164,2.70±0.7327,32.80±0.7678,28.9±0.9119,32.75±0.7164。B,B2组无显著差异,与A,A1组差异有显著性,B1组与B,B2组差异有显著性。免疫组化结果A,A1组显示VEGF在毛细血管内皮细胞胞浆中有少许表达。HIF-1α无表达,两组无明显差异。B,B2组较A,A1组VEGF在毛细血管内皮细胞胞浆和胞核中表达明显增加,HIF-1α在胞核中有表达,两组无明显差异。B1组VEGF在毛细血管内皮细胞胞浆和胞核中表达,HIF-1α在胞核中表达均较B,B2组明显减少。RT-PCR结果显示B组较A,A1组日龄12d VEGF表达下降,14,17d VEGF和HIF-1α表达均增高,差异有显著性。B1组日龄17d VEGF和HIF-1α表达较B组明显下降,A,A1组日龄17d VEGF表达无明显差异,HIF-1α无表达。结论吸入高浓度氧后突然停氧可使HIF-1α与VEGF水平增加。严重影响新生鼠视网膜血管的发育,产生类似ROP病变。用HIF-1α反义寡核苷酸进行玻璃体腔注射可抑制HIF-1α的表达,从而降低VEGF水平,抑制血管新生,达到治疗ROP的作用。