Hepcidin(肝杀菌肽,HEPC)是新近发现的第一种由哺乳动物肝脏特异表达的抗菌肽,属于富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,具有广谱抗菌活性。从鱼类到人类的众多脊椎动物肝脏中均检测到其同源基因,具有很高的保守性。同时,Hepcidin在维持铁代谢平衡中起着关键性的调控作用,参与多种铁代谢疾病的发病机制。Hepcidin的“双重作用”引起广泛的研究兴趣。人们希望实现对Hepcidin基因表达的准确控制,为建立以Hepcidin为靶点的各种铁代谢紊乱疾病的新疗法提供实验依据。从而引发了对参与调控Hepcidin表达的分子的关注。研究表明,Hepcidin属于II型急性时相反应蛋白,其启动子区域存在HNF3β(肝核因子)、C/EBP(CCAAT/增强子结合蛋白)、NF-κB(核因子κB)等转录因子结合位点。虽已证明C/EBPα可能参与Hepcidin的转录调控,仍需进一步探讨其它转录因子在Hepcidin基因表达调控中的作用、途径及效果。以下证据强烈提示NF-κB可能参与Hepcidin急性时相表达的转录调控:⑴从鱼类到小鼠到人类的Hepcidin基因的启动子区域存在NF-κB的结合位点,呈高度保守。⑵Hepcidin作为II型急性时相反应蛋白,其表达在炎症介质的诱导下明显上调,如LPS(脂多糖)和松节油。⑶NF-κB与多种急慢性炎症的发展有关,炎症介质(如LPS)刺激引起NF-κB的活化,与特定的DNA序列结合,发挥其对基因转录的调控作用。⑷NF-κB活化与肝脏中铁的积聚有密切关系,而肝脏铁过量本身是诱导Hepcidin表达升高的原因,NF-κB可能在肝铁超载激发Hepcidin过度表达信号通路发挥作用。⑸肝脏肿瘤的发生、发展与NF-κB表达密切相关;而肝腺瘤表达大量的Hepcidin,是否与NF-κB参与Hepcidin转录调控相关呢?由此,我们设计合成Hepcidin启动子区域NF-κB结合位点探针,研究NF-κB参与Hepcidin基因调控的可能性及其分子机制。目前,研究NF-κB调控靶基因表达常用的研究手段是:①电泳迁移率改变实验(EMSA),确定是否具有与转录因子结合的作用位点;②South-western,确定探针结合的转录因子的分子量;③抗体超迁法,研究是哪个亚基在转录调控中发挥主要作用。这些技术方法成熟、规范,但仍存在不足,如①实验结果不能最终确定该转录因子的确是<WP=12>靶基因的转录调控分子。②缺乏细胞水平或体内实验的进一步验证。因此,如能特异性阻断转录因子表达,再检测受调控的靶基因是否发生改变,就能验证上述实验结果。RNA干涉(RNAi)技术阻断基因表达具有高稳定、高效率和高特异的特点,是当前研究基因功能最有力的工具之一,利用RNAi技术特异阻断NF-κB的表达,在细胞水平分析验证NF-κB对Hepcidin的转录调控作用并研究其分子机制是本课题的出发点。研究目的探讨转录因子NF-κB参与Hepcidin基因急性时相表达的转录调控的可能性;`分析NF-κB参与Hepcidin基因转录调控的分子机制。研究内容和方法一、急性时相反应小鼠模型的建立及NF-κB参与Hepcidin基因转录调控研究1、小鼠急性时相反应模型的建立小鼠腹腔注射LPS诱导急性时相反应。引颈处死小鼠,取肝脏,提取总RNA,采用RT-PCR和Northern blot方法检测Hepcidin表达与LPS注射的时效、剂效关系。并于各剂效点挖眼取血,检测血清铁含量。分析Hepcidin急性时相诱导表达的特点及其与血清铁含量的关系。2、EMSA法初步探讨NF-κB参与Hepcidin基因转录调控的可能性建立急性时相反应小鼠模型。引颈处死小鼠,取肝脏,提取核蛋白。设计合成Hepcidin上游调控序列NF-КB结合位点双链探针,以3’末端填平法标记。EMSA法分析NF-κB对Hepcidin基因转录调控。二、NF-κB基因沉默研究NF-КB调控Hepcidin表达的分子机制1、小鼠肝细胞的原代培养取5周龄昆明小鼠肝组织,采用组织块培养法/酶消化法进行肝细胞的原代培养。通过检测培养上清的白蛋白含量、观察瓶底细胞生长密度选择恰当的转染时间。2、LPS及细胞铁超载诱导Hepcidin表达研究:⑴肝细胞培养基中加入LPS,24h后抽提总RNA,RT-PCR检测Hepcidin的表达。⑵肝细胞的培养基中加入枸橼酸铁,抽提总RNA,RT-PCR检测Hepcidin的表达。3、NF-κB p65亚基特异的siRNA表达载体的构建及鉴定针对NF-κB p65亚基mRNA序列,筛选、设计、合成小干涉RNA(small interfering RNA,siRNA)相关基因片段,构建p65亚基特异的siRNA表达载体pAVU6+27-NFκB,双酶切鉴定及测序验证插入序列的正确性。4、细胞转染及细胞水平研究NF-κB对Hepcidin的转录调控 <WP=13>⑴细胞转染及转染效率鉴定:培养第7天(细胞生长至铺满瓶底80%左右)的原代肝细胞进行基因转染。DOTAP脂质体法瞬时转染原代培养细胞;Western blot法验证NF-κB基因沉默效率;倒置显微镜和透射电镜观察细胞形态学改变。⑵NF-κB对Hepcidin的转录调控研究:检测转染细胞中Hepcidin表达水平的改变;并在转染细胞培养液中加入LPS,24h后抽提总RNA,RT-PCR检测Hepcidin的表达水平。研究结果一、急性时相反应小鼠模型的建立及NF-κB参与Hepcidin基因转录调控研究1、小鼠急性时相反应模型的建立LPS刺激后引起小鼠的急性时相反应。RT-PCR检测Hepcidin在肝脏中的表达明显升高,Hepcidin mRNA水平随剂量的增加而呈逐渐增加的趋势。以50μg/只(2.5μg/g体重