高迁移率族蛋白B1 (high mobility group box-1 protein,HMGB1)为高迁移率蛋白家族成员之一,是20世纪70年代发现的一种含量丰富的非组蛋白性的核蛋白。在核内具有调节基因转录、稳定核小体结构等作用。由于HMGB1与DNA结合不牢固,注定该蛋白在细胞微环境改变(如炎症刺激或是细胞损伤、坏死)时可以被释放至胞浆乃至胞外,进而成为一种重要的晚期炎症介质。现已发现,胞外HMGBl除了参与内毒素血症、缺血再灌注损伤、肿瘤、急性坏死性胰腺炎等急重症疾病的发病过程外,在类风湿关节炎、狼疮性肾炎、炎症性肠病等自身免疫性疾病的发病机制中也具有重要作用。因此,胞外HMGB1在炎症免疫性疾病中的作用受到人们的广泛关注,也由此成为多种炎症免疫性疾病的治疗靶标。炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)包括溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)和克罗恩病(Crohn’s disease, CD),是一种病因不明,发病机制尚不清楚的慢性肠道炎症性疾病,临床上以腹痛、腹泻、粘液脓血便为主要表现。该病在欧美国家发病率比较高,但近年来其发病率在我国也呈快速上升趋势,发病人群以青、壮年多见,且现已被证实容易诱发结直肠癌,成为危害极大的消化道难治性疾病之一。因此,其发病机制和治疗方法一直是该病的研究热点。尽管IBD的病因和发病机制尚未完全明确,但免疫调节紊乱被公认为是目前导致IBD发生发展的最重要因素之一。Th17细胞是一类新发现的不同于Thl和Th2的CD4+T细胞亚群,主要参与炎症及自身免疫性疾病的发病。研究发现,Th17细胞的过度活化在IBD的的发病机制中处于关键地位,有望成为IBD新的治疗靶标。已有研究表明,HMGB1可作为内源性免疫刺激剂通过激活抗原呈递细胞(APC),参与了Th1、Treg CD4+T细胞的分化调控。而其对新发现的Th17细胞的调控作用,目前在自身免疫性心肌炎及心肌移植排斥反应中已得到证实。既然HMGB1和Th17细胞均参与了IBD的病理生理过程,那么两者关系如何?HMGB1是否通过调控Th17细胞的增殖活化参与IBD致病的?这些问题尚未见相关报道,这是本研究所瞄准的科学问题之一。目前IBD的治疗手段非常有限,主要以氨基水杨酸制剂、糖皮质激素、免疫抑制剂和生物制剂为主,这些药物长期使用都有一定的局限性和毒副作用,部分患者仍无法维持临床缓解。因此,寻求高效低毒的治疗药物一直是IBD重要的研究课题。芦荟是一种药用价值极高的植物,民间用其治疗皮炎、溃疡等疾病已有上千年的历史。已有报道鲜芦荟汁灌肠对慢性溃疡性结肠炎患者有较好的临床疗效,但关于其主要生物活性成分芦荟大黄素对结肠炎的治疗效果及确切机制尚未明确,有待研究证实,这也是本研究着重探讨的科学问题。目的：1.1希望通过本项目实施可以明确HMGB1对Th17细胞的调控机制及其在IBD致病中的作用,旨在进一步揭示IBD的发病机制,并为开展以HMGB1为靶标干预Thl7分化的IBD治疗奠定理论基础。1.2基于HMGB1-Th17信号轴研究芦荟大黄素对实验性结肠炎的免疫治疗作用及其可能机制,为明确芦荟大黄素治疗IBD的作用靶点以及临床应用提供理论依据。方法：1.1 HMGB1调控Th17细胞活化在TNBS结肠炎中的致病作用1.1.1动物分组、造模及干预30只BALB/c小鼠随机分为3组(n=10),即乙醇对照组、模型组、丙酮酸乙酯(ethylpyruvate, EP)组。除乙醇对照组灌注100μ150%乙,醇外,其余动物注入2.5%三硝基苯磺酸(trinitrobenzene sulfonic acide, TNBS) 100μl进行灌肠造模。造模8小时后开始给药,EP组每天按100mg/Kg腹腔注射EP溶液,给药体积为0.2ml/10g,对照组和模型组每天以等量乳酸林格液代替,各组均连续给药6天。1.1.2疗效评价①每天观察动物的体重、大便及一般情况,进行疾病活动指数(DAI)评分,给药6天后处死小鼠取材,进行各指标检测；②处死小鼠后,取肛门至回盲部结肠,沿肠系膜纵行剪开进行肉眼病理组织观察,并行结肠组织大体观病理指数(CMDI)评分；③截取病变明显处结肠组织lcm,分别经4%多聚甲醛溶液固定,石蜡切片后常规HE染色进行病理组织学检测,根据镜下改变进行组织学损伤指数(TDI)评分；④小鼠处死前,眼球取血分离血清,采用ELISA法检测血清HMGB1、IL-17及IFN-γ的表达水平；⑤留取小鼠脾脏及肠系膜淋巴结,采用流式细胞仪检测Thl7、Thl/Tcl细胞比例。⑥留取结肠组织经液氮速冻后转至-70℃冰箱中,采用Western blot检测结肠组织中HMGB1表达；⑦结肠组织经冰冻切片后,采用免疫荧光技术检测结肠组织中Th17细胞的浸润表达。1.2芦荟大黄素对TNBS结肠炎模型的药效学研究1.2.1动物分组、造模及干预40只BALB/c小鼠适应性饲养1周后,随机分为5组(n＝8),即乙醇对照组、模型组、芦荟大黄素低剂量组、芦荟大黄素中剂量组、芦荟大黄素高剂量组。除乙醇对照组灌注100μl50%乙醇外,其余动物注入2.5%TNBS 100μ1进行灌肠造模。造模8h后开始给药,低、中、高剂量芦荟大黄素组分别给予75mg/Kg、100mg/Kg、150mg/Kg灌胃给药,对照组和模型组每天以等量生理盐水代替,各组每天灌胃一次,连续6天。1.2.2标本采集及指标检测：动物造模后每日观察动物的体重、腹泻及一般情况,并行DAI评分。6天后处死动物对结肠大体观及组织病理学损伤指数进行评分；称取动物脾脏及胸腺湿重,按公式：脏器质量(mg)／体重(g)×10计算脏器指数。1.3芦荟大黄素对小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1转位的抑制作用常规分离培养小鼠腹腔巨噬细胞,以不同浓度芦荟大黄素(终浓度为10μmol/L, 20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L)或联合1μg/ml的LPS处理细胞,以MTT法检测细胞增殖；以中性红吞噬试验和免疫荧光染色法分别检测细胞的吞噬功能和细胞内HMGB1的转位情况。1.4基于HMGB1-Th17信号研究芦荟大黄素对TNBS结肠炎模型的影响1.4.1动物分组、造模及干预40只BALB/c小鼠随机分为4组(n=10),即乙醇对照组、模型组、芦荟大黄素组及柳氮磺吡啶组。除乙醇对照组灌注100山50%乙醇外,其余动物注入2.5% TNBS100μl进行灌肠造模。造模8h后开始给药,AE组和SASP组每天分别按150mg/Kg、 260mg/Kg灌胃,对照组和模型组每天以0.2ml/10g给予生理盐水灌胃,每天一次,连续6天。1.4.2疗效评价①每天观察动物的体重、腹泻及一般情况,进行疾病活动指数(DM)评分,给药6天后处死小鼠取材,进行检测；②处死小鼠后,取肛门至回盲部结肠,沿肠系膜纵行剪开进行肉眼病理组织观察,并行结肠组织大体观病理指数(CMDI)评分；③截取病变明显处结肠组织1cm,分别经4%多聚甲醛溶液固定,石蜡切片后常规HE染色进行病理组织学检测,根据镜下改变进行组织学损伤指数(TDI)评分；④小鼠处死前,眼球取血离心分离血清,采用ELISA法检测血清HMGB1、IL-17及IFN-γ的表达水平；⑤留取小鼠脾脏及肠系膜淋巴结,采用流式细胞仪检测Th17、Th1/Tcl细胞比例。⑥留取结肠组织经液氮速冻后转至-70℃冰箱中,采用Western blot检测结肠组织中HMGB1表达；⑦结肠组织冰冻切片后,采用免疫荧光检测结肠组织中Th17细胞的表达。结果：1.1 HMGB1调控Thl7细胞活化在TNBS结肠炎中的致病作用1.1.1模型组小鼠DAI评分、CMDI评分及TDI评分均显著高与乙醇对照组(P<0.001),而EP组DAI评分、结肠大体观病理及镜下组织病理评分均明显低于模型组(P<0.001)；1.1.2免疫学指标检测结果TNBS灌肠造模一周后,与对照组比较,模型组小鼠血清和结肠组织中HMGB1蛋白表达明显升高(P<0.001),伴随结肠组织Thl7细胞浸润增多(P<0.001)以及血清IL-17、 IFN-y的表达水平的同步升高(P<0.001)；同时小鼠脾脏和肠系膜淋巴结中Th17细胞及Th1、Te1细胞比例显著升高(P<0.001或P<0.01)。应用HMGB1抑制剂EP干预一周后,与模型组比较,干预组小鼠血清和结肠组织中HMGB1水平明显降低,同时伴随有血清IFN-γ、IL-17水平明显下调,结肠组织中Th17细胞浸润亦显著减少(P(0.01或P<0.001),与此同时脾脏和肠系膜淋巴结中Th17细胞比例以及Th1/Tc1细胞比例也明显降低(P<O.05-P(O.001)。1.2芦荟大黄素对TNBS结肠炎模型的药效学研究1.2.1 TNBS灌肠一周后,模型组小鼠DAI评分、CMDI评分及TDI评分均显著高与乙醇对照组(P<O.01或P<0.001),AE中、高剂量组结肠大体观病理及镜下组织病理均较模型组明显好转,表现为粘膜及粘膜下炎症细胞浸润减少,腺体破坏及粘膜充血、水肿减轻,尤其以高剂量组最为明显,该两组的DAI评分、CMDI评分及TDI评分均比模型组显著降低(P<O.05或P<0.01)。AE低剂量组的DAI、CMDI及TDI三项炎性指标评分与模型组比较均无显著差异性(P>0.05),但与AE高剂量组比较具有统计学意义(P<0.05-P<O.001)；1.2.2脏器指数检测发现,模型组小鼠的脾脏指数明显升高,胸腺指数降低,与对照组比较差异性显著(P<0.001)。而AE高、中剂量组的胸腺指数明显升高,而脾指数明显下降,与模型组比较有显著性差异(P<O.05-P<0.01)。1.3芦荟大黄素对小鼠腹腔巨噬细胞HMGB1转位的抑制作用(10～80) μmol/L浓度范围内的芦荟大黄素无细胞毒性,但可呈剂量依赖性抑制LPS介导的细胞增殖,且在24h后达到高峰(P<0.05-P<0.001)；各浓度组芦荟大黄素处理细胞24h后,可明显降低小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力,与LPS组相比有显著差异性(P<0.001)；免疫荧光检测显示伴随芦荟大黄素浓度的增高,细胞核内的HMGB1的绿色荧光逐渐增强,而胞质内的HMGB1荧光不断减弱；各浓度组芦荟大黄素呈明显剂量依赖性的降低细胞质HMGB1蛋白灰度值,与LPS组相比有显著差异性(P<0.001)。1.4基于HMGB1-Th17信号研究芦荟大黄素对TNBS结肠炎模型的影响1.4.1炎性指标结果芦荟大黄素或柳氮磺吡啶治疗一周后,该两组的DAI评分、CMDI评分及TDI评分均明显低于模型组(P<O.001)；1.1.2免疫学检测结果芦荟大黄素或柳氮磺吡啶治疗一周后,与模型组比较,治疗组小鼠血清和结肠组织中HMGB1水平明显降低(P<O.01或P<0.001),与此同时结肠组织中Thl7细胞浸润显著减少(P<O.01)；此外,脾脏和肠系膜淋巴结的Th17细胞比例及Thl/Tc1细胞比例均明显降低(P<0.05-P<0.001),血清IL-17、IFN-y水平表达也同步下调(P<0.001)。结论：1.1 HMGB1通过调控Th17细胞活化及促进Thl/Tc1型细胞反应在小鼠实验性结肠炎的致病中发挥重要作用；1.2150mg/Kg. d的芦荟大黄素灌胃对小鼠实验性结肠炎有较好的治疗作用；1.3芦荟大黄素可以抑制LPS介导的小鼠腹腔巨噬细胞的增殖、吞噬及HMGB1转位,并呈剂量依赖性；1.4 AE可能通过干预HMGB1介导的Th17细胞反应及Th1/Tc1细胞反应,从而对TNBS诱导的小鼠结肠炎发挥治疗和保护作用。