普通小麦及其近缘种低分子量麦谷蛋白基因克隆与STS标记开发

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小麦低分子量麦谷蛋白亚基(Low-molecular-weight glutenin subunits,LMW-GS)是麦谷蛋白的重要组成部分,对加工品质有重要影响,其编码基因主要位于第一同源群染色体短臂Glu-3位点(Glu-A3、Glu-B3和Glu-D3)。SDS-PAGE(Sodium-dodecyl-sulphate polyacrylamide gel electrophoresis)是鉴定LMW-GS的传统方法,但LMW-GS基因拷贝较多,分子量与醇溶蛋白相近,在SDS-PAGE图谱上易与醇溶蛋白重叠在一起,因而难以区分。为分析LMW-GS编码基因组成,建立快速、准确、有效的鉴别LMW-GS的分子标记辅助选择体系,本研究根据GenBank注册的LMW-GS基因序列,通过比对分析,设计基因特异性引物,克隆Glu-A3和Glu-B3基因;根据基因等位变异的序列差异设计能够鉴别不同低分子量麦谷蛋白亚基的STS标记,并进行有效性验证;此外,还克隆了小麦近缘种Glu-B3位点的等位基因,主要结果如下:1.在含有不同Glu-A3蛋白亚基(a、b、c、d、e、f和g)的Aroona及其近等基因系和Glenlea中克隆了3个Glu-A3基因,分别命名为GluA3-1、GluA3-2和GluA3-3,全部包含完整的编码区域。GluA3-1含有7个等位变异(GluA3-11、GluA3-12、GluA3-13、GluA3-14、GluA3-15、GluA3-16和GluA3-17),GluA3-2含有4个等位变异(GluA3-21、GluA3-22、GluA3-23和GluA3-24),GluA3-3含有6个等位变异(GluA3-31、GluA3-32、GluA3-33、GluA3-34、GluA3-35和GluA3-36)。其中,基因GluA3-1的全部等位变异和GluA3-23和GluA3-24各包含一个完整的开放阅读框,因而能够编码低分子量麦谷蛋白;其它的等位变异为假基因,在开放阅读框中间含有终止密码子。3个基因的推测氨基酸序列AP1、AP2和AP3具有典型的低分子量麦谷蛋白结构特征。其中,AP1和AP3的N-末端为ISQQQQ-,AP2的N-末端为MDTSYIP-。AP1的分子量变化在40.9(AP1-4)~44.8 kD(aAP1-5)之间,AP2的分子量变化在34.1(AP2-2)~34.5 kDa(AP2-4)之间,AP3的分子量变化在37.8(AP3-1)~39.3 kDa(AP3-3)之间。不同的Glu-A3亚基包含不同的等位变异,根据等位变异之间的差异,针对不同的Glu-A3亚基,设计了gluA3a、gluA3b、gluA3ac、gluA3d、gluA3e、gluA3f和gluA3g等7个STS标记,可以准确区分Aroona及其近等基因系和Glenlea的Glu-A3亚基。利用这些标记检测141份CIMMYT材料,结果表明其能够有效地应用于分子标记辅助选择。2.在含有不同Glu-B3亚基(a、b、c、d、e、f、g、h和i)的材料Aroona及其近等基因系和Cheyenne中,克隆了4个Glu-B3基因GluB3-1、GluB3-2、GluB3-3和GluB3-4,共17个等位变异,分别包含一个完整开放阅读框。GluB3-1含有5个等位变异(GluB3-11、GluB3-12、GluB3-13、GluB3-14和GluB3-15),GluB3-2含有3个等位变异(GluB3-21、GluB3-22和GluB3-23),GluB3-3含有4个等位变异(GluB3-31、GluB3-32、GluB3-33和GluB3-34),GluB3-4含有5个等位基因(GluB3-41、GluB3-42、GluB3-43、GluB3-44和GluB3-45)。4个基因的推测氨基酸序列BP1、BP2、BP3和BP4均具有典型的LMW-GS基因特征。BP1、BP2和BP3分子量变化在39.0 kDa(BP1-5)~44.6 kDa (BP3-1)之间,它们的N-末端序列都是MENSHIP-;BP4的分子量为39.0 kDa(BP4-5)或39.8 kDa (BP4-1,BP4-2,BP4-3和BP4-4),其N-末端序列为METSHIP-。不同的Glu-B3亚基包含不同的等位变异,根据不同基因等位变异间的差异,开发了10个能够准确区分Glu-B3a、b、c、d、e、f、g、h和i的功能标记,分别命名为gluB3a、gluB3b、gluB3c、gluB3d、gluB3e、gluB3g、gluB3h、gluB3i、gluB3fg和gluB3bef。利用这10个标记对161份经SDS-PAGE鉴定的材料进行分析,结果表明这些标记能够有效地应用于分子标记辅助育种。3.为进一步降低检测成本,提高效率,利用Glu-A3和Glu-B3的STS标记,构建了Glu-A3b + Glu-A3f、Glu-A3d + Glu-A3f、Glu-A3d + Glu-A3g、Glu-A3b + Glu-A3e、Glu-B3c + Glu-B3d、Glu-B3b + Glu-B3g和Glu-B3h + Glu-B3i等7个多重PCR体系,并检测了141份经SDS-PAGE鉴定CIMMYT材料,结果表明其能够稳定地扩增目标产物,可以应用于分子标记辅助育种。4.利用Glu-B3基因特异性引物LB1F/LB1R、LB3F/LB3R和LB4F/LB4R,对普通小麦B组染色体的7个可能供体近缘种,即硬粒小麦、栽培二粒小麦、野生二粒小麦、拟斯卑尔脱山羊草、高大山羊草、西尔斯山羊草和双角山羊草,共20个材料进行扩增,克隆了16个新的等位变异。其中对应于GluB3-4的新等位变异有12个,分别命名为GluB3-46、GluB3-47、GluB3-48、GluB3-49、GluB3-410、GluB3-411、GluB3-412、GluB3-413、GluB3-414、GluB3-415、GluB3-416和GluB3-417,其推测的氨基酸分子量变化在38.6(GluB3-414)~42.5 kDa(GluB3-413)之间;对应于GluB3-1的新等位变异1个,为GluB3-16,其推测氨基酸分子量为39.2 kDa;对应于GluB3-3的新等位变异有3个,命名为GluB3-35、GluB3-36和GluB3-37,其推测氨基酸分子量为44.5 kDa(GluB3-36)或44.6 kDa(GluB3-35和GluB3-37)。根据推测的氨基酸序列发现,16个Glu-B3等位变异都包含一个完整开放阅读框,具有低分子量麦谷蛋白序列的典型结构。5.应用本研究获得的17个普通小麦Glu-B3基因序列,及在近缘种中获得的16个新的等位变异,构建了1个系统发育树。根据系统发育树及基因扩增特点分析了普通小麦Glu-B3基因的进化特点。推测GluB3-4直接来源于栽培二粒小麦或野生二粒小麦,其二倍体祖先倾向于双角山羊草或部分高大山羊草;基因GluB3-1和GluB3-2来源于野生二粒小麦,基因GluB3-3来源于栽培二粒小麦或硬粒小麦,没有发现这3个基因的二倍体祖先。研究结果揭示了Glu-B3位点基因进化的复杂性,并进一步支持普通小麦起源于多个四倍体近缘种的理论。
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