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众数不孕不育的原因在于女性不孕或受孕异常的细胞分子生物学及发育分子机理尚不明确。受精卵是生命的开始,而早期胚胎致死现象与不孕不育有着极其密切的关系。卵子成功排出与精子结合形成受精卵,其通过细胞分裂进而分化发育为个体。在细胞分裂前中期,中心体及其结合蛋白组装成纺锤体,即有丝分裂器,其牵引染色体整齐排列于赤道板上,帮助染色体平均分配到两个子细胞中。微管由微管蛋白亚基组装而成,是细胞骨架的主要组分之一。α/β-微管蛋白(α/β-tubulin)以二聚体的形式构成微管,α-Tubulin是细胞内游离的微管蛋白的主要结构之一。卵子发生经历了原始卵泡,初级卵泡,次级卵泡,窦状卵泡,卵子成熟排出和黄体生成等过程。有研究表明卵母细胞成熟和随后胚胎成熟的重要环节在于卵泡腔的形成,卵泡腔内颗粒细胞的增殖是保证卵母细胞成熟的关键。卵泡腔形成之后,卵母细胞周围的颗粒细胞一部分增殖分化为卵丘细胞,其依托着卵母细胞逐渐形成卵丘-卵母细胞复合体,另一部分则继续增殖分化。细胞与细胞间的信息交流在卵子发生过程中也尤为重要。在卵泡腔未形成时,腔前卵泡是不受促性腺激素(gonadotropins,Gn)作用的,此时的卵泡发育是受卵母细胞和周围体细胞之间的交流调控的,而在卵泡腔形成之后,卵母细胞的发育就受到了Gn的影响,此时促性腺激素(pregnantmare serum gonadotropin,PMSG)通过促进卵泡刺激素(FSH)与卵泡刺激素受体(FSHR)相互作用而促进卵母细胞进一步发育成熟。本课题在研究微管蛋白αα-Tubulin在细胞周期中动态分布的基础上发现了转基因型小鼠中的胚胎致死现象,因而以FN-T转基因小鼠为实验组,129野生型小鼠为对照组,以生殖器官卵巢为研究对象,研究在正常配种以及在外源促性腺激素条件下,微管蛋白α-Tubulin在小鼠卵泡发育过程中的表达模式及造成胚胎致死的可能原因。本实验通过免疫荧光染色、免疫组织化学分析和实时定量PCR等技术,以小鼠胚胎为出发点,探讨了细胞骨架蛋白α-Tubulin在早期胚胎细胞分裂以及卵泡发育过程中的表达模式。分析结果如下:1.在小鼠1-细胞胚胎中,微管蛋白α-Tubulin以左右伞状的纺锤体结构牵拉着染色体使其整齐排列于赤道板上,参与细胞有丝分裂;在小鼠胚胎2-细胞时期,α-Tubulin以梭形连接体连接着相邻胞体,直至分裂完成;在小鼠4-8细胞时期,部分α-Tubulin以聚合的状态在相邻胞体之间形成中心体连体,保证胞体正常分裂;并且RNA干扰敲低α-Tubulin,胚胎表型出现了多核多极体现象,说明微管蛋白α-Tubulin在细胞分裂过程中有着不可代替的作用。我们在获取胚胎过程中,发现同等条件下转基因小鼠出现了胚胎致死以及卵巢中卵泡充血现象,以此作为延伸展开进一步实验。2.组织病理学分析结果显示:形态上,在促进排卵条件下的FN-T转基因型小鼠卵巢相对于野生型小鼠及正常生理条件下FN-T转基因小鼠卵巢有明显的充血现象,体积也有所增大,且卵泡腔大小统计结果显示,在促进排卵条件下,FN-T转基因型小鼠卵巢横、纵轴长度较野生型小鼠以及正常生理条件下FN-T转基因型小鼠卵巢均呈现极显著性差异(P<0.001),该结果与上述形态学卵巢体积增大结果相一致。对小鼠卵巢进行α-Tubulin免疫荧光染色,结果表明,微管蛋白α-Tubulin在卵子发育时的卵泡腔颗粒细胞中大量表达,且高倍镜下成对出现,其与颗粒细胞增殖密切相关,因而与卵子发生有着重要联系。3.TUNEL检测结果:在促进排卵条件下,FN-T转基因小鼠卵泡发育过程中的初级、次级、窦状卵泡以及排卵后空泡和黄体时期均有大量细胞凋亡,凋亡的细胞主要为颗粒细胞,相对于同等条件下的野生型小鼠以及正常生理条件下的转基因型和野生型小鼠卵泡发育过程中的各个时期细胞凋亡数量均有明显增多,且均存在差异性。尤其是卵泡发育后期,即生成有腔卵泡之后,出现被破坏的颗粒细胞层,颗粒细胞核解体,堆积凋亡等现象。上述现象说明外源促性腺激素会导致α-Tubulin在FN-T转基因小鼠卵巢中的不正常聚合或解聚的状态导致颗粒细胞无法进行正常增殖分化而大量凋亡,最终卵子无法成功排出,甚至胚胎致死现象。4.RT-PCR结果显示:相较于野生型小鼠而言,FN-O转基因小鼠中凋亡相关基因Ca.spase-3,Bax,Bcl-2在mRNA水平上表达量均上调,且存在显著差异性(P<0.01);对于FN-T转基因小鼠而言,基因Caspase-3,Bax,Bcl-2在mRNA水平上较野生型小鼠均上调,二者之间存在差异性(P<0.05)。结论:α-Tubulin微管蛋白在小鼠早期胚胎细胞分裂中有着至关重要的作用。在小鼠胚胎1-胞期时期,α-Tubulin以微管纺锤体的聚合形态参与细胞分裂;在2-8胞期时期,α-Tubulin以梭型连接体的聚合状态牵拉着相邻胞体,帮助细胞准确的完成细胞分裂,所以α-Tubulin在细胞分裂过程中起着很重要的作用。在FN-T转基因型小鼠卵巢组织中,卵泡周围颗粒细胞中细胞骨架蛋白αα-Tubulin的功能受到影响,引起了卵巢颗粒细胞趋向性凋亡,导致卵母细胞无法正常发育,卵子也无法正常排出。此项研究既可以为女性不孕不育症提供有力的科学依据,也可作为治疗早期胚胎死亡的参考数据。