背景现代生活方式的改变使肥胖成为世界范围内的重大流行病,其发病率还在逐年上升,脂肪的过度累积和代谢异常所致的代谢紊乱,胰岛素抵抗、血脂异常和心血管疾病严重威胁人类健康,而肥胖及其并发症的发生均与脂肪组织密不可分。机体内的脂肪组织可以分为白色脂肪(WAT)和棕色脂肪(BAT)。白色脂肪以储存能量为主,也可分泌多种脂肪因子参与调控机体代谢；棕色脂肪的主要功能是产热以维持体温,其线粒体内膜富含解偶联蛋白UCP1,可以将氧化呼吸产生的能量以热的形式散发出去。白色脂肪主要分布在腹腔内脏周围和皮下,细胞呈现为单房脂滴,胞浆成分较少；棕色脂肪主要分布在啮齿类动物和人类新生儿的肩胛间,细胞内有多个多房脂滴和丰富的线粒体,与产热功能相适应。在冷刺激和PPARγ激动剂等诱导下,白色脂肪中会出现形态类似棕色脂肪并且表达UCP1的一类细胞,称为米色脂肪细胞或诱导的棕色脂肪细胞,这一过程称为白色脂肪棕色变。米色脂肪细胞因其高表达UCP1而区别于白色脂肪细胞,但又不同于棕色脂肪细胞,其UCP1的基础水平较低,在受到外界因素的诱导才会高表达。充分激活的米色脂肪细胞UCP1的表达量与棕色脂肪细胞相当,也可通过UCP1解偶联产热,两者统称为产热脂肪细胞。既往认为成人体内不存在BAT,直到2009年应用18F-PET/CT扫描技术证实成人体内存在有活性的BAT。近几年研究发现成人中的BAT不同于动物和新生儿,含有米色脂肪细胞。冷刺激可以激活交感神经末梢释放儿茶酚胺,激活脂肪细胞的β3肾上腺素能受体,通过Gs-cAMP-PKA途径激活脂滴蛋白Perilipin、激素敏感性酯酶和脂肪甘油三酯酯酶,加速脂降解,产生游离脂肪酸。棕色和米色脂肪细胞可摄取目身降解和循环中大量的游离脂肪酸进入线粒体氧化激活UCP1产热。除此以外,活化的WAT还可以摄取循环中的葡萄糖。据此我们推断冷刺激下WAT棕色化和BAT的活化可以改善机体代谢。内脏脂肪(VAT)和皮下脂肪(SAT)均属于白色脂肪,但两者在儿茶酚胺诱导的脂降解的敏感性、脂蛋白脂肪酶的活性及脂肪因子的分泌上都有所不同,内脏脂肪与代谢性疾病的关系更为密切。既往研究发现不同部位脂肪对棕色变的敏感性不同,包括冷刺激在内许多诱导棕色变的因素较易激活小鼠皮下腹股沟处脂肪(subcWAT),而对附睾内脏脂肪(eWAT)作用不明显,因此eWAT也被称为真正的白色脂肪。但以往冷刺激的研究集中在4℃,更冷环境下eWAT的改变未见报道,内脏脂肪是否能由低温诱导棕色化还不明确。本论文拟建立不同程度冷刺激,观察正常和高脂饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠VAT以及SAT、BAT的变化。目的1.研究冷刺激对正常小鼠VAT以及SAT、BAT的影响；2.研究冷刺激对DIO小鼠VAT以及SAT、BAT的影响。方法1.实验动物：所有动物实验均遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会的规定及要求。7-8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠,购自北京华阜康生物科技股份有限公司,引自美国Jackson Laboratory。2.动物实验分组第一部分冷刺激模型的构建(梯度降温)：C57BL/6小鼠随机分四组,30℃对照组和4℃、-10℃和-10℃/-20℃三个冷刺激组。冷刺激组置于18℃适应一周后进入4℃中一周。此后4℃组保持在4℃至4周后实验结束。-10℃和-10℃/-20℃组经白天-5℃、夜晚4℃适应三天后,再经白天-10℃夜晚4℃适应四天。此后-10℃组保持在-10℃中至3周后实验结束。-10℃/-20℃组则保持白天-20℃夜晚-10℃中至实验结束。-10℃和-10℃/-20℃组的饮水频繁更换,并在饲养笼中加入雪霜维持湿润。30℃小鼠直接置于30℃中,时间与冷刺激组保持一致。第二部分C57BL/6给予含60%脂肪的高脂饮食4个月后随机分为30℃,4℃,-10℃和-10℃/-20℃四个组,冷刺激方法同第一部分。3.小鼠核心体温和血压的检测：上午10-12时测量小鼠直肠温度为核心体温；使用小动物血压计通过尾动脉袖套方法测量小鼠血压。4.小鼠脂肪的microPET扫描：小鼠饥饿约3小时后异氟烷吸入麻醉,尾静脉注射200～300 μCi 18F-FDG。一小时后,将小鼠不同部位的脂肪组织快速解剖下来行microPET扫描。5.组织样本收集：小鼠处死前空腹6-8小时,麻醉后称重、测量身长。依次打开腹腔,剪开膈肌,暴露心脏,心尖取血后生理盐水灌注。取出小鼠各部位脂肪组织及脏器等,用于分子生物学检测的组织迅速放入液氮,后置于-800℃；用于免疫组织学染色的则置于4%多聚甲醛中固定,后制备成石蜡切片。6.脂降解水平和血清leptin检测：冷刺激结束时麻醉小鼠,分离eWAT体外用异丙肾上腺素刺激检测脂降解产物甘油的水平。分离血清ELISA检测leptin水平。7.组织学和免疫组化染色：对脂肪组织切片行HE染色和UCP1、线粒体标记物Prohibitin、脂滴包膜蛋白Perilipin A和血管内皮标记物Endomucin的免疫组化染色。eWAT行CD31大体血管染色。8.基因芯片、qRT-PCR和Western Blot:提取正常小鼠新鲜eWAT的mRNA,行Affymetrix GeneChip Mouse Exon 1.0 ST Array芯片分析。实时荧光定量PCR检测eWAT、subcWAT和iBAT中棕色化、脂降解相关产热基因Ucp1、Dio2、Cidea、Cox7al、脂肪因子Leptin、Adiponectin、 Irisin、Resistin及转录因子Pgcla、Prdml6和Ebf2的表达。Western Blot检测提取的新鲜脂肪组织蛋白中UCP1的表达。9.统计学分析：计量资料使用均数±标准误表示,统计分析采用t检验及one-way ANOVA。P<0.05被认为具有统计学差异。结果1.冷刺激对正常小鼠饮食量、体重(BW)、体重指数(BMI)、各部位脂肪重量、各脏器重量、核心体温和血压的影响冷刺激增加小鼠饮食量,各冷刺激组间无显著差异。体重、体重指数、各部位脂肪重量减少。BW、BMI和eWAT、subcWAT重量随温度降低逐渐减少。各冷刺激组心脏增大；肝、脾和肾脏4℃时增大,温度降低而减轻；肺脏无明显变化。各组核心体温和血压无显著差异。2.冷刺激对正常小鼠VAT、SAT和BAT的影响内脏脂肪eWAT、腹膜后脂肪(rWAT)和肠系膜脂肪(mWAT)的HE和脂滴包膜蛋白Perilipin A染色显示冷刺激下脂肪细胞逐渐变小,并出现多房样脂滴结构；棕色化指标UCP1的免疫组化染色阳性证实发生了棕色变。冷刺激程度越大,UCP1的阳性染色越多,线粒体标记物Prohibitin和血管内皮Endomucin、CD31的染色也逐渐增多。冷刺激可以增加subcWAT和iBAT的UCP1、Prohibitin和Endomucin染色,subcWAT的棕色化程度随温度的降低升高,而各冷刺激组间iBAT分析无统计学差异。qPCR和WB检测UCP1的表达显示冷刺激可以上调各部位脂肪UCP1的mRNA和蛋白水平。MicroPET扫描显示随着温度的降低eWAT和subcWAT对18F-FDG的摄取增加,iBAT对18F-FDG的摄取在30℃时最低,冷刺激时明显增加。3.基因芯片及冷刺激对正常小鼠各部位脂肪产热基因、脂肪因子和棕色化相关转录因子mRNA水平的影响基因芯片结果显示冷刺激可引起正常小鼠eWAT中一系列与代谢相关的通路改变,促进脂降解的相关基因表达上调。qPCR结果显示冷刺激可上调正常小鼠eWAT和subcWAT中与棕色化及脂降解相关的产热基因Dio2、Cidea和Cox7al的表达,下调脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin的表达,对Resistin影响不大,棕色化相关转录因子Pgcla变化不明显,Prdml6和Ebf2表达降低或不变。除轻度上调Dio2外冷刺激显著下调iBAT中Cidea、Cox7al、Leptin、Adiponectin、Irisin、Resistin、Pgclα、Prdm16和Ebf2表达,提示冷刺激对不同部位脂肪的作用不同。4.冷刺激对DIO小鼠进食量、体重、体重指数、各部位脂肪重量的影响冷刺激下DIO小鼠进食量增加,体重、体重指数、各部位脂肪重量减少。BW、BMI和eWAT、subcWAT重量随温度降低逐渐减少,iBAT在各冷刺激组差别不明显。5.冷刺激对DIO小鼠VAT、SAT和BAT的影响对肥胖小鼠内脏脂肪eWAT、rWAT和mWAT的HE和脂滴包膜蛋白PerilipinA染色显示热中性时脂肪细胞直径较大,胞内为单个大脂滴,胞浆成分很少,低温冷刺激可使脂肪细胞变小,并出现多房样脂滴,UCP1染色呈现阳性。温度越低,UCP1的表达量、线粒体含量和血管的密度也逐渐增高。冷刺激可减小肥胖小鼠subcWAT和iBAT的脂肪细胞大小,增加UCP1、Prohibitin和Endomucin染色。subcWAT的棕色化程度随温度的降低升高,而分析各冷刺激组间iBAT无统计学差异。肥胖小鼠subcWAT的棕色化程度明显弱于正常小鼠。6.冷刺激对DIO小鼠各部位脂肪中产热基因、脂肪因子和棕色化相关转录因子的mRNA水平影响qPCR结果显示冷刺激可上调肥胖小鼠eWAT和subcWAT中产热基因UCP1、 Dio2、Cidea和Cox7al的表达；不同程度下调脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin的mRNA水平；转录因子Pgcla的表达升高,Prdm16和Ebf2表达降低。冷刺激上调肥胖小鼠iBAT中产热基因UCP1和Dio2表达,下调Cidea、Leptin、 Adiponectin、Resistin、Pgcla、Prdm16和Ebf2表达,Cox7a1、Irisin变化不明显。7.冷刺激对正常和DIO小鼠脂降解的影响体外加入ISO刺激检测eWAT的脂降解产物甘油水平显示冷刺激促进正常和肥胖小鼠的脂降解。结论1.冷刺激可减少正常及DIO小鼠各部位脂肪蓄积,并且此作用不依赖于进食量；2.冷刺激可诱导正常小鼠VAT发生棕色变,同时激活BAT和皮下脂肪,VAT对冷刺激诱导棕色变的敏感性低于SAT；3.冷刺激可诱导DIO小鼠VAT发生棕色变,同时激活BAT和皮下脂肪,与正常小鼠相比DIO小鼠SAT对冷刺激的敏感性较低；4.冷刺激可改变VAT的表达谱,促进脂降解相关基因表达,加速脂降解；5.冷刺激在转录水平上影响VAT、SAT和BAT中产热基因、脂肪因子和转录因子的表达,并且对各部位脂肪的作用不同。背景全球有超过1.9亿的肥胖或超重人口,肥胖造成的胰岛素抵抗、糖尿病、血脂紊乱、心血管疾病和脂肪肝等一系列代谢障碍给社会造成了沉重负担,而针对肥胖及其并发症的有效治疗手段进展甚微。脂肪组织可根据机体需要随时贮存和释放脂质,其生理功能与全身代谢密切相关。脂肪细胞代谢紊乱是肥胖等代谢性疾病的主要病理生理基础。目前认为机体内存在白色、棕色和米色三种脂肪细胞(AC)。不同类型AC在形态、来源、分布和功能上各不相同,白色AC主要功能是贮存甘油三酯和分泌脂肪因子,棕色AC则主要通过线粒体底物氧化和UCP1解偶联释放热量。米色AC在形态和产热功能上类似棕色AC,在外界刺激下高表达UCP1,因此也称作可诱导的棕色AC。在儿茶酚胺、FGF-21和Irisin等因子作用下WAT中可出现米色AC,即WAT发生了棕色变。研究发现米色脂肪细胞在调控机体能量稳态方面有重要作用。肥胖患者体内米色AC减少,适应性产热能力下降。Sv129小鼠WAT招募米色AC的能力比C57BL/6小鼠强,相同饲养条件下脂肪的蓄积明显少于C57。敲除小鼠所有来源于Myf5+细胞的1A型BMP受体会导致棕色脂肪(BAT)的缺失,相对应大量WAT棕色化而弥补了BAT缺失导致的产热不足。脂肪细胞特异性敲除PRDM16对BAT无明显作用,但明显抑制了WAT的棕色化,可加重高脂饮食下肥胖、胰岛素抵抗和脂肪肝的发病。据此我们推断WAT棕色化可以改善机体代谢。肥胖引发的胰岛素抵抗(IR),是造成2型糖尿病流行的重要因素。过度累积的脂肪出现代谢障碍,造成多余的脂质异位蓄积在肝脏、肌肉中,引发脂毒性；脂肪细胞还可分泌多种因子,触发炎症反应等,多种因素综合作用导致IR和血脂紊乱的发生。脂肪组织,尤其是血流直接入肝脏的内脏脂肪(VAT)的异常扩增,可以分泌Adiponectin、Leptin、IL-6和IL-1β等脂肪因子及饱和、不饱和脂肪酸调控肝细胞的代谢和炎症反应,加剧肝脏代谢紊乱,尤其是非酒精性脂肪肝(NAFLD)的发病。生活在高海拔地区的人和住在海平面附近的人相比空腹血糖更低,葡萄糖耐受更好。而且高海拔人群中肥胖和糖尿病的发病率更低,但具体原因不明,我们推测可能与生存环境温度的差异激活脂肪组织有关。Shah RV等人研究发现不论BMI, VAT的蓄积与心血管危险因素和冠状动脉钙化相关,而且相对于皮下脂肪,VAT与代谢综合征的发病率相关性更强；2012年JAMA报道了大规模Dallas心脏研究中的发现,肥胖患者VAT的量与IR程度和将来进展为T2DM的危险性相关；另有研究发现BAT活化的人较BAT阴性的对照NAFLD的发病率低。由此可见脂肪组织,尤其是VAT在IR和NAFLD的发病过程中起重要作用,而靶向VAT的干预手段有助于改善这些并发症。本论文拟通过正常小鼠和高脂饮食诱导的肥胖模型,研究冷刺激诱导VAT棕色变后全身代谢包括NST能力、脂质代谢、胰岛素敏感性和肝脏脂质沉积等的改变并进行相关机制研究。目的1.研究不同程度冷刺激对小鼠代谢的影响；2.研究内脏脂肪棕色变改善小鼠代谢的相关机制。方法1.实验动物：7-8周龄雄性C57BL/6野生型小鼠购自北京北京华阜康生物科技股份有限公司,引自美国Jackson Laboratory。129S-Ucp1tmlKz/J小鼠,购自美国Jackson Laboratory。所有动物实验均遵守山东大学齐鲁医院伦理委员会对动物实验的规定及要求。2.动物实验分组第一部分正常小鼠冷刺激模型的构建：同论文Ⅰ。第二部分饮食诱导的肥胖(DIO)小鼠冷刺激模型的构建：同论文Ⅰ。第三部分附睾脂肪去除和移植实验：手术去除eWAT后行冷刺激,冷刺激方法同论文Ⅰ。脂肪移植实验30℃的小鼠随机分为两组,分别接受等量来自-10℃/-20℃或30℃小鼠的eWAT。第四部分UCP1-/-小鼠实验：对UCP1-/-小鼠实施冷刺激。第五部分p3肾上腺素能受体激动实验：室温下C57BL/6小鼠随机分两组,一组接受β3肾上腺素能受体激动剂CL316243腹腔注射,另一组接受等量的生理盐水作为对照。3. 小鼠血糖、糖耐量和胰岛素耐量的检测使用罗氏血糖仪和试纸检测血糖。糖耐量实验小鼠过夜饥饿12h,胰岛素耐量实验小鼠饥饿6 h,冷刺激组置于18℃、30℃组置于30℃饥饿。给予小鼠腹腔注射2g/kg体重葡萄糖或0.5U/kg(正常小鼠)或0.75U/kg(肥胖小鼠)体重胰岛素之前和15、30、60、90和120分钟后采尾端血测定血糖。4.小鼠代谢率的检测：麻醉好的小鼠放置于33℃的小动物呼吸代谢检测仪中测量30分钟基础状态下的氧耗量和二氧化碳呼出量,皮下注射1mg/kg体重去加肾上腺素后继续检测90分钟代表非战栗性产热(NST)能力。5. 小鼠eWAT去除和移植手术：麻醉固定小鼠,外科手术操作,取下腹部正中纵向切口,暴露并钝性分离去除附睾脂肪。对照组仅打开腹腔,移动附睾脂肪。术后一周后开始18℃适应期,冷刺激方法同前。麻醉小鼠后固定,备皮并消毒。取出供体小鼠eWAT,生理盐水冲洗后剪碎,植于受体小鼠eWAT的褶皱中。6. 小鼠基因型鉴定及核心体温检测：鼠尾组织提取DNA, PCR扩增后琼脂糖凝胶电泳,根据片段大小确定基因型。上午10-12时测量小鼠直肠温度为核心体温。7.组织样本收集：小鼠处死前空腹6-8小时,麻醉后称重、测量身长。依次打开腹腔,剪开膈肌,暴露心脏,心尖取血后生理盐水灌注。取出小鼠各部位脂肪组织及脏器等,用于分子生物学检测的组织快速放入液氮,后置于-80℃；用于免疫组织学染色的则置于4%多聚甲醛中固定,后制成石蜡或冰冻切片。8.小鼠血脂、血胰岛素水平的检测：冷刺激结束时麻醉小鼠并留取血液,检测血清中TC、LDL-C、HDL-C、TG和NEFA的含量。应用ELISA检测血胰岛素水平。9. 小鼠eWAT肌酸激酶、肌酸和磷酸化肌酸的检测：冰上裂解制备eWAT的匀浆,分别检测CK的活性,Creatine和PCr的含量。10.组织学和免疫组化染色：对脂肪组织石蜡切片行HE染色和UCP1、Prohibitin、Perilipin A和Endomucin的免疫组化染色。对肝脏冰冻切片行油红O染色。11. qRT-PCR:提取新鲜eWAT的RNA,实时荧光定量PCR检测产热基因UCP1、Dio2、 Cidea、Cox7al、脂肪因子Leptin、Adiponectin、Irisin、Resistin及转录因子Pgcla、 Prdm16和Ebf2的表达。12.统计学分析：计量资料以均数±标准误表示,统计分析采用t检验、one-way ANOVA和two-way ANOVA。P<0.05认为有统计学差异。结果1. 冷刺激对正常小鼠代谢的影响NST检测冷刺激可显著增加小鼠的氧耗量和二氧化碳呼出量,-10℃和-10℃/-20℃的氧耗量和二氧化碳呼出量高于4℃,冷刺激显著增强小鼠代谢,提高适应性产热能力。冷刺激可以显著降低血TG、NEFA和LDL-C的水平,TG的降低呈现温度依赖性,温度越低下降越明显。冷刺激有降低TC、HDL-C的趋势,-10℃/-20℃组TC、HDL-C水平低于其他各组。空腹血糖各组间无统计学差异,-10℃/-20℃组的空腹胰岛素水平显著降低,GTT和ITT实验显示-10℃和-10℃/-20℃组血糖水平和曲线下面积低于30℃和4℃,说明内脏脂肪棕色化可以改善小鼠糖耐量和胰岛素耐量。2.冷刺激对DIO小鼠代谢的影响与30℃相比,冷刺激可增加DIO小鼠的代谢,-10℃和-10℃/-20℃组的NST能力高于4℃。冷刺激显著降低血TG、TC和LDL-C的水平,-10℃和-10℃/-20℃组TG水平低于4℃组。冷刺激可以明显降低DIO小鼠的空腹血糖和空腹胰岛素水平,-10℃和-10℃/-20℃组血糖和胰岛素水平低于4℃组。GTT和ITT实验显示各-10℃和-10℃/-20℃组血糖水平和曲线下面积低于30℃和4℃,证实冷刺激改善肥胖小鼠糖耐量和胰岛素耐量。冷刺激可以减轻DIO小鼠肝脏重量,减少肝内的脂质沉积。3. 内脏脂肪棕色化可激活Creatine驱动的替代产热途径,但UCP1主导的产热起主要作用冷刺激可以增加eWAT中肌酸激酶(CK)的活性,棕色化程度越高,CK活性越高。冷刺激可增加eWAT中Creatine的含量,同时降低PCr的含量,-10℃/-20℃组Creatine含量最高,PCr含量最低,表明CK/Cr/PCr途径被激活。冷刺激可降低UCP1-/-小鼠核心体温,致使在零下低温环境中无法存活,表明替代产热途径无法取代UCP1介导的产热。4. eWAT的活化对全身代谢的影响eWAT去除后正常小鼠在低温环境下的死亡率增高,NST能力受损,氧耗量、二氧化碳呼出量和胰岛素敏感性均低于对照组。对热中性小鼠移植活化的eWAT可使其NST能力比移植等量白色eWAT的小鼠增加。说明激活的内脏脂肪参与调控机体代谢。5. β3肾上腺素能激动剂CL316243对小鼠脂肪和代谢的影响CL316243 (CL)处理模拟了冷刺激对小鼠脂肪的作用。与对照组相比,CL组的体重、体重指数、各部位脂肪重量减少。CL处理组eWAT、subcWAT和iBAT的脂肪细胞比盐水组减小,UCP1表达量、线粒体含量和血管密度明显增加。与对照相比,CL组eWAT的产热基因mRNA水平升高,脂肪因子和棕色化相关转录因子表达不同程度降低。CL处理还可以降低血TG、TC、LDL-C水平,改善糖耐量和胰岛素耐量。结论1.冷刺激可促进正常和DIO小鼠的代谢和NST能力,激活的内脏脂肪可影响小鼠的整体代谢。2. 冷刺激可降低正常和DIO小鼠血TG,改善糖耐量和胰岛素耐量,减少DIO小鼠肝脏的脂质沉积。3.棕色化的内脏脂肪可同时利用UCP1和Creatine驱动的线粒体底物循环增加产热。4.p3肾上腺素能受体激活可能是冷刺激诱导内脏脂肪棕色化并改善代谢的主要机制。