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目的:探索内向整流钾离子通道KCNJ15（Potassium inwardly-rectifying channel,subfamily J,member 15,KCNJ15）对哮喘小鼠气道炎症的影响。方法:1.钾离子通道蛋白筛选:通过RNA测序筛选出卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）诱导的过敏性哮喘气道炎症模型中差异表达的钾离子通道。取12只8周龄雌性C57BL/6J小鼠,6只对照组小鼠不做任何处理,另外6只用OVA致敏和激发,构建过敏性哮喘气道炎症模型。造模结束后根据苏木素-伊红（Hematoxylin and eosin,H＆E）染色结果选择肺部炎症细胞浸润最明显的小鼠进行RNA测序。分析RNA测序数据,选择表达变化最明显的钾离子通道蛋白。2.KCNJ15表达定位分析:根据Lung GENs数据信息库和免疫组织化学染色确定KCNJ15在肺部的表达位置。3.高效感染肺部的腺相关病毒（Adeno-associated virus,AAV）类型筛选。小鼠气管滴注AAV2、AAV6、AAV6.2和AAV9四种带GFP荧光的腺相关病毒,感染10天后取肺组织,免疫荧光染色比较四种血清型AAV的感染细胞类型与感染效率。4.构建和筛选敲低目的基因质粒:使用PEI转染试剂在NIH3T3细胞中转染带GFP荧光的三种KCNJ15短发夹RNA（Short hairpin RNA,sh RNA）质粒。将NIH3T3分组为KCNJ15 sh RNA-1组（转染KCNJ15 sh RNA质粒1）、KCNJ15 sh RN-2组（转染KCNJ15 sh RNA质粒2）、KCNJ15 sh RN-3组（转染KCNJ15 sh RNA质粒3）、sh RNA-KCNJ15对照组（转染KCNJ15sh RNA-NC的质粒）和空白对照组（正常培养不做转染）。各组细胞经过悬浮转染处理48 h后,流式细胞仪筛选出GFP阳性的细胞,提取RNA后使用实时定量基因扩增荧光检测系统（Real-time Quantitative PCR Detecting System,q PCR）技术检测KCNJ15的敲低效率。5.构建过表达目的基因质粒:使用Attractene转染试剂在293T细胞中转染带GFP荧光的KCNJ15过表达质粒。将293T细胞分组为KCNJ15过表达组（转染KCNJ15过表达质粒）和空白对照组（正常培养不做转染）。各组细胞经过转染处理36 h后,蛋白质印迹法检测KCNJ15的过表达效率。6.OVA诱导小鼠气道炎症造模及AAV滴注:取48只8周龄雌性C57BL/6J小鼠随机分成6组（每组8只）:NC组、OVA组、OVA+sh RNA KCNJ15组、OVA+sh RNA KCNJ15 NC组、OVA+KCNJ15过表达组和OVA+KCNJ15过表达NC组。NC组使用生理盐水致敏和激发,其余组使用OVA致敏和激发构建过敏性哮喘气道炎症模型。在致敏后的第11天进行气管滴注。NC组不做任何滴注处理。OVA组滴注50μl无菌生理盐水。OVA+sh RNA KCNJ15组滴注50μl的5×1011GC的AAV6-sh RNA KCNJ15病毒。OVA+sh RNA KCNJ15 NC组滴注50μl的5×1011GC的AAV6-sh RNA KCNJ15 NC病毒。OVA+KCNJ15过表达组滴注50μl的5×1011GC的AAV6-KCNJ15过表达病毒。OVA+KCNJ15过表达NC组滴注50μl的5×1011GC的AAV6-KCNJ15过表达NC病毒。7.气道高反应性检测:最后一次OVA雾化24 h后进行气管吸入激发实验检测小鼠气道高反应性。乙酰甲胆碱浓度分别为50 mg/ml、25 mg/ml、12.5 mg/ml、6.25 mg/ml、3.125 mg/ml和0 mg/ml。肺功能仪设置为适应1 min,雾化1 min,测量3 min,休息1 min。测量结束后导出数据以便后续分析。8.哮喘小鼠气道炎症分析:取支气管肺泡灌洗液检测总细胞数量和嗜酸性粒细胞数量;H＆E染色检测肺部气道周围炎症细胞浸润;PAS染色检测气道杯状细胞增生;ELISA检测支气管肺泡灌洗液中白细胞介素-4（Interleukin-4,IL-4）、白细胞介素-5（Interleukin-5,IL-5）、白细胞介素-13（Interleukin-13,IL-13）等炎症因子的表达;ELISA检测血清OVA特异性Ig E及OVA特异性Ig G1水平。9.KCNJ15表达检测:AHR测量结束24 h后杀鼠取材。提取48只小鼠的右中叶肺RNA,q PCR技术检测NC组、OVA组、OVA+sh RNA KCNJ15组、OVA+sh RNA KCNJ15 NC组、OVA+KCNJ15过表达组和OVA+KCNJ15过表达NC组的小鼠肺内KCNJ15的m RNA表达量。通过检测以上指标确定KCNJ15对哮喘气道炎症的影响。结果:1.RNA测序数据表明内向整流钾离子通道KCNJ15在过敏性哮喘气道炎症模型小鼠肺中的表达量升高（P＜0.05）。2.Lung GENs数据库分析和免疫组织化学分析确定KCNJ15主要在小鼠气道上皮细胞表达。通过筛选AAV2、AAV6、AAV6.2和AAV9四种血清型AAV,发现AAV6感染气道上皮细胞效率最高。3.比较KCNJ15 sh RNA质粒1、KCNJ15 sh RNA质粒2和KCNJ15sh RNA质粒3敲低KCNJ15的效率,结果显示KCNJ15 sh RNA质粒2敲低KCNJ15的效率相对最高。验证构建的过表达KCNJ15的质粒,结果显示其在细胞中的表达效率较高。4.在OVA诱导的小鼠过敏性哮喘气道炎症模型中,与sh RNA KCNJ15NC组相比,KCNJ15敲低组小鼠的气道高反应性明显增强（P＜0.05）,与KCNJ15过表达NC组相比,KCNJ15过表达组小鼠的气道高反应性明显减弱（P＜0.05）。q PCR检测成功敲低或过表达小鼠肺部KCNJ15后,通过支气管肺泡灌洗液细胞计数、H＆E染色、PAS染色、支气管肺泡灌洗液IL-4、IL-5和IL-13含量、血清OVA特异性Ig E及OVA特异性Ig G1水平评估敲低组哮喘小鼠气道炎症。与sh RNA KCNJ15 NC组相比,sh RNA KCNJ15敲低组小鼠支气管肺泡灌洗液中总细胞数量和嗜酸性粒细胞数目升高（P＜0.05）,与KCNJ15过表达NC组相比,KCNJ15过表达组小鼠支气管肺泡灌洗液中细胞总数和嗜酸性粒细胞数量降低（P＜0.05）。H＆E染色结果显示与sh RNA KCNJ15 NC组相比,sh RNA KCNJ15敲低组小鼠气道周围的炎症细胞浸润更加严重,与KCNJ15过表达NC组相比,KCNJ15过表达组小鼠气道周围的炎症细胞浸润减轻。PAS染色结果显示与sh RNA KCNJ15NC组相比,sh RNA KCNJ15敲低组小鼠气道杯状细胞增生加重,与KCNJ15过表达NC组相比,KCNJ15过表达组小鼠气道杯状细胞增生减轻。ELISA实验结果显示与sh RNA KCNJ15 NC组相比,sh RNA KCNJ15敲低组小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和IL-13的水平升高（P＜0.05）,与KCNJ15过表达NC组相比,KCNJ15过表达组小鼠支气管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5和IL-13的水平降低（P＜0.05）。血清ELISA实验结果显示与sh RNA KCNJ15NC组相比,sh RNA KCNJ15敲低组小鼠血清中OVA特异性Ig E和OVA特异性Ig G1的水平升高,与KCNJ15过表达NC组相比,KCNJ15过表达组小鼠血清中OVA特异性Ig E和OVA特异性Ig G1的水平降低（P＜0.05）。结论:KCNJ15在哮喘小鼠肺部特异性高表达。敲低过敏性哮喘小鼠肺部KCNJ15后,加重气道高反应性及气道炎症。过表达过敏性哮喘小鼠肺部KCNJ15后,减轻气道高反应性及气道炎症。