【摘 要】
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甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤,分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）和甲状腺滤泡状癌。尽管大多数甲状腺乳头状癌患者在经过手术、放射性碘治疗后预后良好,但药物耐药性（维罗非尼,特异性BRAF抑制剂）和放射性碘治疗难治性甲状腺乳头状癌仍然是导致甲状腺癌相关死亡的重要原因之一。BRAF抑制剂能激活Hedgehog信号通路而产生治疗抗性,靶向抑制
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甲状腺癌是最常见的内分泌肿瘤,分化型甲状腺癌包括甲状腺乳头状癌（Papillary thyroid carcinoma,PTC）和甲状腺滤泡状癌。尽管大多数甲状腺乳头状癌患者在经过手术、放射性碘治疗后预后良好,但药物耐药性（维罗非尼,特异性BRAF抑制剂）和放射性碘治疗难治性甲状腺乳头状癌仍然是导致甲状腺癌相关死亡的重要原因之一。BRAF抑制剂能激活Hedgehog信号通路而产生治疗抗性,靶向抑制Hedgehog信号通路可能增强甲状腺癌细胞对BRAF抑制剂的敏感性。同时,Hedgehog信号通路的组分均定位于初级纤毛上,BRAF抑制剂对Hedgehog信号通路的激活是否依赖于完整的初级纤毛结构尚未明确。目的:本研究旨在阐明GLI1抑制剂（HPI-4）是否能增强PTC细胞对BRAF抑制剂（PLX7904）的敏感性;PLX7904对Hedgehog信号通路的激活是否依赖于初级纤毛组装;采用纤毛组装抑制剂（Nocodazole）是否增加PTC对PLX7904的敏感性。方法:1、MTT检测PLX7904、HPI-4和Nocodazole的细胞毒性计算其IC50,并选取合适药物浓度来做接下来的生物学行为和机制实验。2、通过Western Blot免疫印迹法检测PLX7904、PLX7904联合HPI-4和PLX7904联合Nocodazole处理后,GLI1、ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白在甲状腺乳头状癌细胞中的表达情况。3、通过免疫荧光法检测加入PLX7904之后,观察初级纤毛的组装情况。4、通过TCGA数据库挖掘BRAFV600E突变的甲状腺乳头状癌组织中GLI1蛋白表达情况的数据,之后进行生存分析曲线绘制。5、通过MTT、平板克隆、划痕、Transwell和流式细胞术探讨PLX7904协同HPI-4或协同Nocodazole对甲状腺乳头状癌细胞增殖、迁移、侵袭和细胞周期分布的影响。6、通过流式细胞术检测PLX7904协同HPI-4对PTC细胞凋亡的影响。7、通过免疫荧光技术检测PLX7904协同HPI-4或协同Nocodazole对PTC细胞初级纤毛组装的影响。结果:1、PLX7904、HPI-4和Nocodazole在KTC-1细胞中的IC50值分别是1.3μM、33.3μM、0.07μM;在TPC-1细胞中的IC50值分别是9.8μM、21.1μM、0.07μM。2、BRAF抑制剂PLX7904促进GLI1的表达以及初级纤毛的组装。3、GLI1抑制剂HPI-4增加了BRAF抑制剂PLX7904促进凋亡、抑制增殖、阻滞细胞周期的作用。4、HPI-4增强了PLX7904对PTC细胞迁移和侵袭的抑制作用。5、HPI-4增强了PLX7904对PTC细胞ERK信号通路的抑制作用。6、HPI-4抑制了PLX7904对PTC细胞初级纤毛组装的促进作用。7、纤毛组装抑制剂Nocodazole部分反转由BRAF抑制剂导致的GLI1上调。结论:Hedgehog信号通路的激活是导致BRAF抑制剂化疗耐药性的潜在分子机制。Hedgehog信号通路的激活依赖于初级纤毛的组装。甲状腺乳头状癌细胞中,靶向Hedgehog信号通路和抑制初级纤毛的组装对于增加BRAF抑制剂的敏感性是一个新的治疗策略。
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