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研究背景和目的：宫颈癌是常见妇科恶性肿瘤,人乳头瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染是宫颈癌的主要病因。表观遗传学事件在癌症的发生过程中起着重要的作用,几乎所有的癌症类型均表现出异常的甲基化状况,且涉及全基因组。本研究旨在分析临床样本中HPV16病毒长控制区增强子(LCR Enhancer)和E6基因启动子(E6promoter)两段序列中的11个位点(7533、7551、7674、7680、7692、7860、31、37、43、52、58)的甲基化图谱,结合患者的临床资料,分析病毒DNA甲基化程度差异与临床病变程度的相关性,初步探讨甲基化程度差异与宫颈癌发生发展的关系,为今后从分子生物学、表观遗传学角度阐明HPV致病机制,进而预测患者宫颈病变的进展及预后等相关问题提供研究基础。研究方法和步骤：所用的TCT标本均来自2009年11月至2010年6月在北京协和医院门诊就诊的宫颈病变及常规妇科检查的患者,一共收集TCT标本324例,其中HPV感染244例,用多对引物PCR扩增分型后确定单一型别HPV感染146例,混合感染98例。其中单一HPV16感染51例(ASCUS6例,正常5例,LSIL7例,HSIL19例,SCC14例)。在对原始标本提取DNA后,从单一HPV16感染中选择26例、从混合感染中选择4例(HPV16感染为主,细胞学诊断均为正常),总计30例样本纳入全程研究。其中正常组6例(4例为混合感染),LSIL组7例,HSIL组10例,SCC组7例。另从医科院基础所细胞中心购得SiHa细胞系1株作为平行对照。SCC组全部病例和HSIL组部分病例有北京协和医院病理科的病理诊断。从原始样本中提取DNA,然后用试剂盒对提取的DNA行重亚硫酸盐修饰,再用BSP引物PCR扩增目的片段,在电泳验证目的片段存在后,将PCR产物质粒转化E.coli克隆,随机挑取数个克隆,对目的片段进行测序,从而确定目的片段中每一个CpG位点的甲基化状况。采用描述性和图表的方法来汇总分析数据,根据图谱可以直观的反映出CpG位点的甲基化频率。同时采用SPSS13.0for windows统计软件分析数据。组间甲基化率差异比较用Fisher精确概率检验,P<0.05有统计学意义。各位点的甲基化率用Student’s t检验,显著高于0(与0比较P<0.05)有统计学意义。结果：1、实验中一共测序确定了1013个CpG位点的甲基化状况,一共有45个CpG位点发生甲基化,总体甲基化率为4.4%。在11个CpG位点中,位点7533、7551、7680、7860均未测得甲基化发生,位点7674、7692的总体甲基化率约为2%,位点31、37、43、52、58的总体甲基化率约为8%。2、绝大多数的甲基化都发生在SCC组。SCC组在7674、31、37、43、52、58位点上发生了明显的甲基化,7674位点甲基化率约为8%,余各位点甲基化率在20%以上,均显著高于0(Student’s t检验,P<0.0001)。SCC组与HSIL组间甲基化率差异显著(P<0.01,Fisher精确概率检验)。3、正常组和LSIL组甲基化现象罕见,但由于样本量限制,正常组/LSIL组与HSIL组/SCC组间无法进行有意义的统计学比较。4、测定了1株SiHa细胞的5个拷贝的甲基化情况,在LCR Enhancer序列的5个位点有甲基化发生。结论：1、在LCR Enhancer的5个位点(7533、7551、7674、7680、7692)上的甲基化率很低；在E6promoter的31、37、43、52、58位点上的总体甲基化率约为8%,7862位点的甲基化率低。2、绝大多数的甲基化发生在SCC组,SCC组与HSIL组相比甲基化率有显著差异。3、正常组和LSIL组中罕见甲基化发生。4、在SiHa细胞系中的HPV16病毒基因组的甲基化型别具有异质性。