【摘 要】
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目的:脑神经胶质瘤是最常见的脑部恶性肿瘤之一,具有高致死率及高复发率等特点,在脑实质内浸润生长是脑胶质瘤的显著特征,这一特性使手术切除病灶几乎不可能。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因定位在染色体7p12,编码的蛋白是一种跨膜受体酪氨酸激酶(EGFR/HER1/ERBB1)。EGFR的细胞外结构域与双调蛋白(AR)、EGF或TGF-α
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目的:脑神经胶质瘤是最常见的脑部恶性肿瘤之一,具有高致死率及高复发率等特点,在脑实质内浸润生长是脑胶质瘤的显著特征,这一特性使手术切除病灶几乎不可能。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因定位在染色体7p12,编码的蛋白是一种跨膜受体酪氨酸激酶(EGFR/HER1/ERBB1)。EGFR的细胞外结构域与双调蛋白(AR)、EGF或TGF-α结合后能促进EGFR形成二聚体,促使细胞内酪氨酸激酶的磷酸化,激活细胞内下游的信号通路,从而调控细胞的生长、增殖、侵袭、转移、凋亡等生物学过程。目前的研究均已知:EGFR的异常激活与肿瘤的发生发展密切相关,EGFR基因在人神经胶质瘤中高表达,与患者的预后呈现负相关。Jineol是中药蜈蚣中分离提取的一种单体成分,已有研究提示它对多种肿瘤细胞具有生长抑制及促凋亡的作用,但是其作用机制尚不明确。本研究拟采用人神经胶质瘤细胞系U87评价Jineol的抗肿瘤活性并探讨其作用机制,为中药蜈蚣治疗脑神经胶质瘤提供理论基础,同时也为中药来源的单体化合物抗肿瘤研究提供借鉴和参考。方法:1.Jineol对胶质瘤U87细胞活力的影响检测:采用10、20和40μM的Jineol处理细胞后,CCK8法检测细胞在24 h、48 h、72 h的存活率。2.Jineol对胶质瘤U87细胞运动迁移和侵袭能力的影响检测:采用10、20和40μM的Jineol处理细胞后,划痕实验检测Jineol对U87细胞迁移能力的影响,细胞侵袭实验检测Jineol对U87细胞侵袭能力影响。3.Jineol对胶质瘤U87细胞周期分布及细胞凋亡的影响检测:采用10、20和40μM的Jineol处理细胞后,PI染色法及Annexin V-FITC/PI双染法染色标记各组细胞,然后将各组细胞进行流式细胞仪上机检测,Flow Jo软件分析统计各细胞周期数比例及Annexin V-PI双阳细胞比例。4.Jineol对胶质瘤U87细胞EGFR及其下游信号通路的影响:采用10、20和40μM的Jineol处理细胞后,RT-PCR及蛋白质免疫印迹实验(Western blot)测定各处理组细胞EGFR的m RNA水平及蛋白相对表达量;Western blot实验测定各处理组细胞p-ERK、p-AKT、PCNA、Cyclin D1、Bcl-2、Bax、PARP、Caspase-3、P53和PTEN蛋白的相对表达量;结果:1.CCK8实验显示:相比Control组,使用10、20和40μM的Jineol处理后胶质瘤U87细胞存活率显著降低(P均<0.001),且随着Jineol给药浓度的增加呈剂量依赖性。2.划痕实验及侵袭实验结果表明:相比Control组,3个实验组Transwell小室穿膜细胞数量及迁移距离均显著降低(P均<0.001),且呈现剂量依赖性。3.流式细胞检测结果提示:Jineol呈剂量依赖性上调U87细胞G1期细胞比例升高,下调S期细胞比例(P均<0.001)4.EGFR及其下游信号通路检测结果显示:相比Control组,Jineol呈剂量依赖性显著下调EGFR m RNA水平、p-EGFR/EGFR水平和p-AKT、p-ERK、PCNA、Cyclin-D1、Bcl-2、PARP、Caspase-3蛋白表达水平(P均<0.05)和上调Bax、P53、PTEN蛋白表达水平(P均<0.05)。结论:本研究证实Jineol能显著抑制脑神经胶质瘤细胞的体外增殖和侵袭迁移,促进细胞凋亡,其主要是通过抑制EGFR通路的激活影响下游信号通路来发挥抗胶质瘤的作用。
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