背景软骨缺损修复、软骨支架移植一直以来是整形外科及骨关节外科医生面临的非常严峻的挑战。自上世纪90年代末,组织工程软骨在裸鼠背部构建再造耳的研究成果被报道,二十余年来,软骨组织工程技术有了长足的发展。间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSC）中脂肪来源的间充质干细胞（adipose-derived mesenchymal stem cell,ADSC）由于来源广泛,创伤性小、免疫原性低、能调节炎症反应等诸多优点,在组织工程的种子细胞选择中越来越受到重视。然而,单纯从机体体内提取的ADSC数量有限,难以满足组织工程大量的种子细胞需求,须进行体外扩增。目前商业化的可吸收的微载体中使用最为广泛的是CultiSpher系列微载体,该类微载体由明胶材料制成,其理化性质难以满足ADSC成软骨诱导复杂的需求。丝素蛋白（silkfibroin,SF）提取自天然蚕丝,是近年来在软骨组织工程中极具应用潜力的一类天然材料,但力学强度不足,我们结合其与左旋聚乳酸（Poly-L-lactic acid,PLLA）制备了 SF-PLLA微载体,将其用于ADSC的培养和成软骨分化,并将成软骨分化产物用于裸鼠体内移植,以期寻找一种更加适合ADSC培养和成软骨诱导分化的微载体。研究目的1.将ADSC以较低密度分别接种于CultiSpher G微载体和SF-PLLA微载体（密度为2.5×106cells/150mg）。并采用含血清的培养基进行扩增培养,比较不同微载体对ADSC的扩增效率、对ADSC分化潜能以及对其表面标志物表达的影响;2.将ADSC以较高密度分别接种于CultiSpher G微载体和SF-PLLA微载体（密度为2×107cells/150mg）,并采用含TGF-β3的成软骨诱导培养基进行成软骨诱导分化培养,比较不同微载体对ADSC的细胞存活情况、分化能力以及GAG、COL2分泌能力的影响;3.将体外构建的组织工程软骨联合软骨细胞移植入裸鼠皮下,构建体内组织工程软骨,并分析两种微载体构建所得软骨的差异。研究方法1.从脂肪抽吸手术的吸脂液中提取人ADSC,对其进行培养,并行流式细胞学检测和三系分化鉴定,证实所提取细胞为ADSC;2.将ADSC接种于CultiSpher G微载体和SF-PLLA微载体,体外三维条件下扩增培养18d,比较两者增殖率、细胞分布及活死情况,qPCR检测扩增后ADSC成软骨相关基因、成骨相关基因、成脂相关基因的表达情况,流式细胞学检测ADSC扩增后表面标志物,三系诱导分化检测ADSC扩增后的分化能力;3.将ADSC接种于CultiSpher G微载体和SF-PLLA微载体,体外三维条件下成软骨诱导培养21d,比较两者细胞存活率、细胞分布及活死情况,qPCR检测成软骨分化诱导后ADSC成软骨相关基因表达情况,组织学染色检测GAG、COL2分泌及表达;4.将两种微载体体外成软骨诱导的微载体-ADSC+软骨细胞复合物移植至裸鼠侧背部,8周后取材,观察其大体外观及组织学染色情况。研究结果1.两种微载体对ADSC扩增18d的总扩增效率无明显统计学差异（p>0.05）。在体外三维条件下扩增培养18d后,SF-PLLA微载体上ADSC成软骨分化相关基因明显升高,CultiSpher G微载体上ADSC成脂分化相关基因明显升高（两者均p<0.05）;两种微载体上扩增后的ADSC依然保持了多系分化能力和干细胞表面标志物表达;2.两种微载体在体外三维条件下成软骨诱导培养21d,两者细胞存活总量无明显差异（p>0.05）,SF-PLLA微载体组的ADSC成软骨诱导后SOX9、ACAN、COL2基因表达量高于CultiSpher G组,差异具有统计学意义（p<0.05）;组织学染色结果显示,两种微载体均成功实现体外成软骨诱导;3.体内实验结果显示,SF-PLLA微载体组体内组织工程软骨形态、质地更佳,组织学染色结果显示两组诱导产物均见明显软骨陷窝,且有大量GAG及COL2聚积。研究结论1.SF-PLLA微载体可用于ADSC的扩增,其扩增后细胞依旧保持干细胞能力,且成软骨潜力上调;2.SF-PLLA微载体用于ADSC成软骨诱导分化,成软骨效果比商业微载体CultiSpher G微载体更好;3.两种体外成软骨分化的微载体-ADSC联合软骨细胞作为植入物均可实现裸鼠体内构建成熟的组织工程软骨,其中基于SF-PLLA微载体构建的组织工程软骨形态、质地更佳,可作为软骨组织工程支架材料的更优选择。