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固有免疫（innate immunity）应答是机体抵抗外源性病原菌侵入以及清除体内自身抗原性异物的第一道防线。固有免疫应答针对的靶信号有病原体相关的外源性危险信号称为病原相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns,PAMPs）和自身细胞释放的内源性危险信号称为损伤相关分子模式（Damage-associated molecular patterns,DAMPs）。PAMPs和DAMPs的识别需要通过模式识别受体（Pattern recognition receptors,PRRs）。NLRP3（NOD-like receptor（NLR）family,pyrin domain-containing-3）是胞浆内重要的模式识别受体之一,是目前研究最广泛的模式识别受体。NLRP3通过与接头蛋白ASC（Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD）以及活性蛋白Caspase1形成炎症小体复合物的形式对信号做出应答。炎症小体复合物组装完成,Caspase1经过自剪切形成活性形式的Caspase1,活性形式的Caspase1可以剪切Pro-IL-1β（Interlukin-1β）和Pro-IL-18,形成有活性的IL-1β和IL-18。同时活性形式的Caspase1将打孔蛋白GSDMD（Gasdermin D）剪切成C-GSDMD和N-GSDMD,N-GSDMD迁徙并锚定在细胞膜上,在细胞膜上形成一个孔道引起焦亡发生,有活性的IL-1β和IL-18可以通过此孔道释放到胞外引起组织的炎症反应。文献报道NLRP3炎症小体广泛参与到疾病的发生发展,如感染性疾病、心血管疾病、自身免疫病、神经退行性疾病、精神类疾病等。但目前NLRP3炎症小体抑制剂存在种类少、副作用大、难以转化等难题,因此开发新型有效的NLRP3炎症小体抑制剂将会有非常重要的临床意义。精油（Essential oils,EOs）是从芳香植物中提取的具有挥发性的低分子量有机物液体混合物。EOs成分具有多种生物活性,包括抗菌、抗真菌、抗病毒和抗氧化等特性,长期以来一直被用于医疗和美容等行业。目前越来越多的研究揭示了EOs成分在体内外不同炎症模型中的抗炎作用。然而EOs成分发挥抗炎作用的机制尚不完全清楚。此外,由于EOs成分复杂其具有抗炎作用的活性化合物需要进一步鉴定。针对以上问题,本课题希望通过建立稳定的NLRP3炎症小体激活体系,此体系筛选出EOs组分中可以抑制NLRP3炎症小体的具体单一组分,阐明这些组分抑制NLRP3炎症小体的具体机制,并通过不同的神经系统疾病模型验证这些组分对于神经系统疾病的作用,为后续临床应用提供坚实的理论和实践基础。首先本课题以永生化的骨髓来源的巨噬细胞作为模式细胞,LPS作为第一刺激信号,尼日利亚菌素作为第二刺激信号,成功建立起稳定的NLRP3炎症小体激活和评价体系。利用此体系成功的筛选出1,2,4-三甲氧基苯（1,2,4-Trimethoxybenzene,1,2,4-TTB）、α-松油醇（alpha-Terpineol）可以有效抑制NLRP3炎症小体下游Caspase1的剪切和IL-1β的释放。并通过细胞活力检测鉴定出1,2,4-TTB具有更小的细胞毒性。为了系统性评价1,2,4-TTB对NLRP3炎症小体的抑制效应,本课题选用了不同的单核巨噬细胞（原代腹腔巨噬细胞、原代小胶质细胞）作为模式细胞,应用了多种炎症小体激动剂（ATP、Imiquimod、Pam3CSK4）,均验证了1,2,4-TTB对NLRP3炎症小体激活具有抑制作用。机制方面:通过K+荧光探针标记发现1,2,4-TTB可以抑制单核巨噬细胞K+外排;ASC寡聚实验和NLRP3寡聚实验以及细胞免疫荧光实验发现1,2,4-TTB可以有效地抑制NLRP3以及ASC寡聚体的形成;免疫共沉淀实验揭示了1,2,4-TTB可以抑制NLRP3与ASC的相互结合;通过小分子蛋白质相互作用预测出1,2,4-TTB和NLRP3蛋白的Q225位点有较高的结合概率,与ASC蛋白的S195位点也存在着较高的结合可能。这部分结果证明了1,2,4-TTB一方面可以抑制K+外排,另一方面可以通过与NLRP3蛋白结合抑制NLRP3寡聚体形成,进而抑制NLRP3炎症小体组装。在体研究方面:本课题发现低剂量的LPS（0.5mg/kg）两次注射在不引起强烈系统性炎症的同时在第二次注射后可以有效地诱导脑组织中NLRP3炎症小体激活,发现了新的研究NLRP3炎症小体激活的神经炎症动物模型,并在此模型基础上发现1,2,4-TTB可以有效地抑制NLRP3炎症小体激活;本课题选用实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis,EAE）小鼠模型通过灌胃给药评价1,2,4-TTB对EAE小鼠的保护效应,发现药物可以减少EAE模型小鼠的临床评分,延缓小鼠的体重下降,病理切片及生化分子实验分析发现小鼠脊髓脱髓鞘面积明显减少,小胶质细胞激活显著减轻,数量显著减少,NLRP3炎症小体的激活被显著抑制;为了多模型验证1,2,4-TTB的效应本课题评价了药物对创伤性应激障碍（Post‐traumatic stress disorder,PTSD）的改善效果,结果表明药物可以加快电击引起的恐惧记忆的消除,消除场景恐惧,减轻小鼠焦虑样和抑郁样表型。综上所述:本课题从EOs成分中筛选出1,2,4-TTB是一种特异性的NLRP3炎症小体抑制剂。并且揭示了1,2,4-TTB一方面可以通过抑制细胞K+外排,抑制NLRP3炎症小体激活,另一方面可以抑制NLRP3蛋白自联寡聚,进而抑制NLRP3炎症小体的组装。在体研究方面:建立了新的可以研究NLRP3炎症小体激活的神经炎症动物模型,在此动物模型上验证了1,2,4-TTB可以有效地抑制NLRP3炎症小体诱导的神经炎症;在EAE模型小鼠、PTSD模型小鼠中验证了1,2,4-TTB对NLRP3炎症小体参与的神经系统疾病具有明显的保护效应,为神经系统疾病的预防和治疗提供了新的思路以及理论和实践基础。