背景:幽门螺杆菌（Helicobacter pylori,H.pylori）作为一种全球流行的人类病原体,是导致胃溃疡乃至胃癌的重要风险因子之一。清除幽门螺杆菌感染有助于预防胃部疾病的发生。近年来,幽门螺杆菌的耐药性风险越来越高使得抗生素治疗策略存在隐患。疫苗成为了防控幽门螺杆菌感染的新选择,然而,迄今为止仍没有一款疫苗进入临床应用。探寻新颖高效的疫苗研发策略不仅需要筛选鉴定能够诱导高效免疫保护的抗原,还需要辅以能够递呈和刺激抗原引发免疫保护反应的佐剂,二者缺一不可。因此,研发一款有效的幽门螺杆菌疫苗不仅要关注疫苗候选抗原组分的筛选与鉴定,也要关注新颖疫苗佐剂的设计。外膜囊泡（Outer membrane vesicles,OMVs）作为革兰阴性菌外膜囊泡化而自发产生的一种纳米级颗粒,已在脑膜炎奈瑟菌、沙门菌、鲍曼不动杆菌上被作为疫苗抗原组分或佐剂进行广泛研究,而在幽门螺杆菌疫苗研发上还未见报道。因此,本课题聚焦外膜囊泡用于幽门螺杆菌疫苗研发的潜能,纯化外膜囊泡,分析蛋白组成,并对其本身的免疫原性特征以及作为佐剂的有效性进行综合评估,以明确将外膜囊泡应用于幽门螺杆菌疫苗研发的最优策略。目的:1.纯化幽门螺杆菌外膜囊泡,分析其蛋白组成和亚细胞定位,为将其应用于幽门螺杆菌疫苗研发奠定基础。2.通过评估幽门螺杆菌外膜囊泡作为抗原的免疫原性以及其作为佐剂对幽门螺杆菌疫苗免疫保护效率的影响,明确将外膜囊泡应用于幽门螺杆菌疫苗研发的最优模式。3.初步阐明外膜囊泡在不同使用模式下诱导产生免疫保护的分子机制。方法:1.通过密度梯度超速离心法纯化幽门螺杆菌外膜囊泡,经冷冻电镜（Cryo-EM）观察外膜囊泡外观形态;采用SDS-PAGE分析外膜囊泡蛋白图谱;采用液相色谱串联质谱法（LC-MS/MS）鉴定外膜囊泡蛋白组,并应用PSORTb软件预测蛋白组分的亚细胞定位情况;在体外进行细胞毒性实验评估外膜囊泡的安全性。2.将C57BL/6小鼠随机分组,以外膜囊泡作为抗原组份,分别以100μg和200μg剂量经口服途径免疫小鼠,以评估外膜囊泡自身的免疫保护效力;设置全细菌疫苗（Whole cell vaccines,WCV）为对照,每组给予霍乱毒素（Cholera toxin,CT）作为佐剂;于初次免疫后的第4周进行一次加强免疫;分别于第4周和第8周收集血清和阴道分泌物,于第8周处死部分小鼠收集脾细胞进行抗原刺激,采用定量ELISA检测血清Ig G、胃黏膜和阴道分泌物中分泌型Ig A水平,以及脾细胞经抗原刺激后不同免疫类型细胞因子含量（IL-10、IL-4、IL-13、IL-12）用以评估免疫保护反应类型;于第9周用野生型幽门螺杆菌感染小鼠,2周后处死小鼠并收集胃黏膜组织用于脲酶检测和细菌载菌量测定,以评估外膜囊泡作为抗原对幽门螺杆菌感染的保护效力。3.将C57BL/6小鼠随机分组,以卵清蛋白（ovalbumin,OVA）作为模式抗原,幽门螺杆菌外膜囊泡作为佐剂,通过口服途径免疫小鼠,设置霍乱毒素（CT）佐剂作为对照组,测定其诱导OVA产生Ig G和分泌型Ig A水平,通过模式抗原初步评估外膜囊泡的佐剂效力;随后探究外膜囊泡作为佐剂在幽门螺杆菌疫苗中的应用潜力,以幽门螺杆菌外膜蛋白（Outer membrane proteins,OMPs）或全菌疫苗（WCV）作为抗原组份口服免疫小鼠,每组给予5μg或10μg的外膜囊泡作为佐剂成分,同时以CT佐剂作为对照组,于初次免疫后的第4周进行一次加强免疫;每隔2周收集样品,采用定量ELISA检测血清Ig G、胃黏膜和阴道分泌物分泌型Ig A水平,以及脾细胞经抗原刺激后不同免疫类型细胞因子含量（IFN-γ、IL-4、IL-13、IL-17、IL-12）用以评估免疫保护反应类型,于第14周用野生型幽门螺杆菌感染小鼠,2周后处死小鼠并收集胃黏膜组织用于脲酶检测和细菌载菌量测定,以评估外膜囊泡作为佐剂对幽门螺杆菌感染的保护效力。结果:1.Cryo-EM观察可知分离得到的幽门螺杆菌外膜囊泡中不含菌体及鞭毛成分,证实外膜囊泡未被其他细菌组分污染,可用于后续实验;共鉴定到外膜囊泡中含有169种蛋白,根据PSORTb软件进行蛋白定位预测,不同部位蛋白占比如下:胞质（34.8%）、内膜（7.5%）、周质（13.5%）、外膜（31.4%）、胞外蛋白（4%）和未知位置（8.8%）。其主要组分聚集在外膜和胞质中;低剂量幽门螺杆菌外膜囊泡孵育RAW264.7巨噬细胞不会导致其活性的显著降低,但在高剂量（＞50μg）作用时会呈现一定细胞毒性作用。2.与WCV免疫组相比,200μg外膜囊泡作为抗原免疫小鼠后可引起强烈的体液免疫和黏膜免疫应答,具体表现为血清中Ig G水平、胃黏膜分泌型Ig A水平以及阴道分泌物中分泌性Ig A水平显著提高（P＜0.01）;通过测定Ig G亚型(Ig G1、Ig G2c)和细胞因子水平发现外膜囊泡免疫后主要介导产生Th2型免疫应答;相比对照组,外膜囊泡作为抗原可有效降低幽门螺杆菌感染后在动物体内产生的脲酶含量以及细菌载量（P＜0.01）。3.幽门螺杆菌外膜囊泡作为佐剂可有效提高模式抗原OVA刺激小鼠产生Ig G和分泌型Ig A的水平。将外膜囊泡佐剂应用于幽门螺杆菌疫苗免疫保护评估实验结果显示,相比于传统佐剂CT,纯化的外膜囊泡作为佐剂仅需5μg即可使小鼠产生更强且更长时间的免疫反应,并能刺激更为高效的胃黏膜与阴道分泌物分泌性Ig A水平的产生（P＜0.01）。以外膜囊泡作为包被抗原,检测不同免疫组对外膜囊泡本身的免疫反应发现,外膜囊泡作为佐剂的实验组并未产生针对外膜囊泡的免疫反应,这提示外膜囊泡作为佐剂诱导抗原产生免疫反应主要发挥的是免疫刺激作用而非免疫原作用。同时,外膜囊泡作为佐剂,相比CT佐剂,能有效刺激Ig G2c亚型的产生以及IL-4、IL-13和IL-17细胞因子的产生（P＜0.01）,并能有效降低幽门螺杆菌感染后胃黏膜组织的脲酶含量以及细菌载量（P＜0.01）。结论:1.成功纯化得到未被其他细菌组分污染的幽门螺杆菌外膜囊泡,并在外膜囊泡中共鉴定到169种蛋白,主要为外膜蛋白和胞质蛋白,一方面证实成功得到纯度较高的外膜囊泡,另一方面充分了解其组分背景,为外膜囊泡应用于幽门螺杆菌疫苗研发奠定基础。2.幽门螺杆菌外膜囊泡可引起强烈的体液和黏膜免疫反应,并能显著降低幽门螺杆菌的胃内定植,其诱导产生的免疫保护反应主要以Th2型免疫反应为主,具备作为疫苗抗原的潜力,但其在高剂量使用时可能会存在安全风险。3.幽门螺杆菌外膜囊泡作为佐剂仅需5μg即可显著提高疫苗组分抗幽门螺杆菌感染的保护效力,其发挥佐剂效应是通过免疫刺激作用而非免疫原发挥作用,诱导产生免疫保护反应类型主要以Th2和Th17型免疫反应为主,且不存在安全性风险,进一步证实外膜囊泡作为佐剂可作为最优策略开发重组幽门螺杆菌疫苗。