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RNA沉默是普遍存在于真核生物体内抵御外来核酸入侵的序列特异性降解机制。植物利用RNA沉默抵御病毒侵染，而病毒则通过编码沉默抑制子干扰RNA沉默途径。沉默抑制子针对RNA沉默途径的不同环节起作用，通过对其沉默抑制方式的研究，可以深入了解RNA沉默机制及病毒、寄主互作规律，为利用RNA沉默培育抗病毒农作物品种提供理论依据。P25是由马铃薯X病毒编码的25kD蛋白，是一种较弱的RNA沉默抑制子，能够协助病毒在细胞间运输是PVX病毒的致病因子。本研究以非翻译PVYNCP转基因抗病毒烟草为母本，P25转基因烟草为父本，进行常规杂交，筛选携带CP和P25基因的双转基因烟草子代，接种PVYN病毒检测其抗病性。通过抗病性分析和分子杂交，探讨稳定表达的P25蛋白对RNA沉默介导抗病性的影响；并对P25转基因烟草生长发育异常及相关miRNA表达变化进行初步探讨。主要研究结果如下：（1）P25、PVYNCP双转基因烟草的获得和鉴定。分别播种P25和PVYNCP转基因烟草种子，经PCR和Western blot检测筛选稳定表达P25的转基因植株；PCR扩增结合PVYN病毒接种筛选PVYNCP转基因抗病植株。利用稳定表达P25的转基因烟草为父本，PVYNCP基因介导的PVY抗病毒转基因烟草去雄后与之进行常规杂交，所得子代经过PCR和Western blot检测，成功筛选到携带P25和PVYNCP基因的双转基因植株。（2）P25、PVYNCP双转基因烟草的抗病性分析。双转基因烟草生长至4-5片真叶时接种PVYN病毒，接种10天后所有双转基因植株均表现系统感病，出现典型褪绿斑症状。ELISA检测表明，在感病植株中存在高滴度的PVYN病毒。Northern blot分析表明，双转基因植株中PVYNCP mRNA表达水平明显高于发生RNA沉默的母本植株。以上结果表明，在植物体内异源表达的P25蛋白仍能发挥其RNA沉默抑制功能，导致PVYNCP转基因植株抗病性丧失，P25虽为弱沉默抑制子，但在强启动子CaMV35S启动下表达量较高，烟草转基因植株中表现出较强的沉默抑制能力。（3）P25转基因烟草中与生长异常相关的生理指标的测定。研究过程中发现，与野生型烟草相比，相同生长期的P25转基因烟草及P25、PVYNCP双转基因烟草均表现出叶片发黄、下部叶片提前枯萎等生长异常现象，叶色由绿变黄和枯萎，通常是叶绿素降解的结果，而叶绿素分解是衰老的原发过程和标志，因此推测P25蛋白可能促使叶片衰老。我们分析比较了P25转基因烟草与野生型烟草叶绿素含量及叶绿素降解密切相关的两种酶——超氧化物歧化酶（SOD）和过氧化物酶（POD）的活性。结果表明， P25转基因烟草与野生型烟草相比，叶绿素含量降低54%，叶绿素a/叶绿素b明显低于野生型烟草。SOD是机体内天然存在的O-2清除因子，其活性下降导致O-2积累；而过氧化物酶（POD）参与了叶绿素的降解，其活性与衰老呈高度负相关。分析表明，与野生型烟草相比，P25转基因烟草SOD的活性降低25%，POD活性提高2.5倍。另外还测定了与光合能力直接相关的一系列光合指标，结果表明，与野生型烟草相比，P25转基因烟草的净光合速率（Pn）降低45%，蒸腾速率（EVAP）降低36%、气孔导度（Gs）降低50%，而细胞间隙CO2浓度（Ci）仅降低3%，表明气孔导度的降低和蒸腾速率的下降可能是导致净光合速率降低的主要原因，而细胞间隙CO2浓度基本不变，自然状态下，只有当气孔导度与细胞间隙CO2浓度以相同的方式变化时，才能确定Pn的下降是气孔限制造成的。所以我们认为P25转基因烟草净光合速率的降低是由非气孔限制造成。（4）P25转基因烟草miRNA的表达量分析。miRNA参与生长发育相关基因的表达调控及细胞分化、增殖和凋亡等过程，影响着几乎所有的信号通路，参与多种生理病理过程。与植物抗病毒siRNA沉默途径一样，miRNA途径也受到病毒沉默抑制子的干扰。miRNA在加工上与siRNA共享着一些相似的蛋白和路径,都是Dicer蛋白加工的产物,都需要解旋酶的参与，所结合的复合体siRISC和miRISC都包含有至少一个Agonaute家族蛋白。在miRNA途径上起重要作用的基因DCL1和AGO1，各自受到miR162和miR168的负调控。利用qRT-PCR比较分析了miR162、miR168的表达水平，与野生型烟草相比，P25转基因烟草的miR162、miR168的表达水平分别提高2.8倍和3.7倍。说明P25作为沉默抑制子干扰siRNA途径的同时也干扰miRNA途径。P25转基因烟草中调控DCL1表达的miR162的积累量显著增加，推测P25可能对DCL1的表达产生影响。利用qRT-PCR比较分析转基因和野生型烟草中4种与生长发育密切相关的miR156，miR165，miR167和miR171的表达水平，它们分别调控植物的开花，发育模型，激素应答和转录因子，与野生型烟草相比，P25转基因烟草中，miR156、miR165、miR167、miR171的表达水平分别提高2.0倍、3.2倍、4.7倍和1.8倍，这表明，P25蛋白普遍影响与生长发育有关的miRNA的表达水平，产生生长发育异常如提前衰老、开花推迟等表型，揭示了P25作为病毒致病因子的作用机制。