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目的:原发性干燥综合征（Primary Sj?gren’s syndrome,p SS）是一种慢性自身免疫性疾病,通常影响外分泌腺涉及口唇和泪腺,导致患者常常主诉口干和眼干,并往往成为患者就医的首发症状。病理特征在于血循环中存在器官特异性或非特异性自身抗体,外分泌腺会由淋巴细胞介导受到损伤,若未及时合理的治疗,可能会导致机体多种器官受损发展成全身性慢性免疫性疾病。p SS患者病理切片会观察到唾液腺体间质出现淋巴细胞浸润、腺体导管损害以及腺泡萎缩,而淋巴细胞主要以CD4+T细胞为主,目前对其发病机制尚不明确。国内外学者普遍认为,以CD4+T细胞为主的免疫细胞比例不平衡,从而产生多种促炎细胞因子,并作为重要的致病因素参与了p SS的发病机制。近年来,T细胞亚群失衡及其分泌的多种细胞因子的致病作用在p SS等自身免疫病中的作用越来越受到人们的重视。T辅助细胞17（Th17）作为一种新型CD4+T细胞亚群,在p SS的发病机制中发挥重要作用,其通过分泌白细胞介素17（IL-17）、白细胞介素6（IL-6）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等多种细胞因子,进而诱发炎症反应,参与p SS的发病机制。调节性T细胞（Treg）是抑制性T细胞,抑制效应T细胞激活和增殖维持外周免疫耐受,在多种自身免疫性疾病中发挥重要抑制功能。Th17与Treg相互制衡保持稳态,但是体内局部细胞因子微环境等的变化,很容易诱导幼稚T细胞向Th17细胞或者Treg细胞的不同方向分化,其比例极易失衡,从而导致病理性细胞分化增殖,引发自身免疫性疾病。多种自身免疫性疾病与改变的Th17/Treg比例相关,研究表明,Th17/Treg的失衡同样在干燥综合征（Sj?gren’s syndrome,SS）的发病过程中发挥重要作用。近年来的一些临床及动物试验提示,Th17/Treg的比例失调改善后,SS患者常见的口、眼干燥的临床症状能够减轻,组织病理学显示颌下腺等的外分泌腺炎症反应能够减轻。白细胞介素35（IL-35）是一种新型的细胞因子,在类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis,RA）的动物模型中能够促进Treg细胞增殖,抑制CD4效应T细胞增殖及功能,包括Th1细胞和Th17细胞。目前关于IL-35在干燥综合征中的研究很少,我们通过对SS动物模型NOD/Ltj小鼠进行IL-35治疗,并分析IL-35治疗后NOD/Ltj小鼠外分泌腺的病理改变,及对Th17、Treg亚群的影响,从而探讨IL-35是否可以通过调节Th17/Treg平衡,进而在SS治疗中发挥的作用。此外,多项研究表明,JAK/STAT信号通路参与了SS的发病机制,该信号通路能够被许多I型和II型细胞因子激活,白细胞介素2（IL-2）、IL-6是其中重要的I型细胞因子,在炎症反应、细胞凋亡、应激、细胞周期和运动、生长等多种病理和生理过程中发挥重要作用。IL-35在RA、心血管疾病、系统性红斑狼疮（Systemic lupus erythematosus,SLE）、急性肾损伤（AKI）等疾病中,对JAK/STAT信号通路具有调节作用,而SS患者唇腺活检标本检查提示存在JAK/STAT信号通路的异常。因为JAK/STAT信号通路同时是参与Th17、Treg分化的重要上游信号通路,综上我们推测,作为SS动物模型的NOD/Ltj小鼠体内也可能存在JAK/STAT信号通路异常,而IL-35也可能对该信号通路具有调节作用,进而可以调节Th17/Treg平衡,在p SS中起到治疗作用。目前,国内外尚无相关研究,故我们通过对此展开一系列研究,试图为p SS的治疗寻求新的靶点。非肥胖型糖尿病小鼠（NOD/Ltj non-obese diabetic,简称NOD/Ltj）小鼠是自发SS的动物模型鼠,其在10周龄时淋巴细胞在唾液腺灶性浸润明显,并且开始出现唾液腺分泌功能下降,并随着小鼠周龄的增长病情逐渐加重,唾液腺分泌功能至20周龄时丧失;多种SS患者的特有自身抗体在其血清中存在,这些疾病特征均与人类SS相似,近年来成为研究自发型干燥综合征典型的动物模型,本研究的开展也以NOD/Ltj小鼠作为试验研究对象。研究方法:1.第一部分:以SPF级9周龄的ICR小鼠10只以及9周龄SS动物模型NOD/Ltj小鼠40只为研究对象,将ICR小鼠及NOD/Ltj小鼠进行分组:C为空白对照组（ICR小鼠）;M为模型对照组（NOD/Ltj小鼠）;羟氯喹（HCQ）+M为羟氯喹治疗对照组（NOD/Ltj小鼠+羟氯喹水溶液0.5 m L/day）;IL-35 I+M为IL-35干预组I低剂量组（NOD/Ltj小鼠+IL-35 3μg/day）;IL-35 II+M为IL-35干预组II高剂量组（NOD/Ltj小鼠+IL-35 6μg/day）;每组均10只,适应性喂养1周后,待10周龄小鼠发病后,给药6周,给药结束后处死小鼠。试验期间监测小鼠全身情况及生物学行为,体重,饮水量,唾液流量。小鼠取材后,测量颌下腺、脾脏的重量;计算颌下腺指数、脾脏指数;采用HE染色法,评估小鼠颌下腺及胰腺组织病理变化并进行分析,探寻经过IL-35治疗后对NOD/Ltj小鼠外分泌腺免疫损伤的病理影响;通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测各组小鼠外周血中与Th17、Treg细胞亚群密切相关的细胞因子水平:IL-17（Th17分泌的重要下游细胞因子）、IL-6（促进Th17分化的重要细胞因子）、IL-10（Treg分泌的重要下游细胞因子）、IL-2（促进Treg分化的重要细胞因子）,分析通过IL-35处理后外周血中上述细胞因子表达水平的变化;多重免疫荧光、流式细胞术（FCM）分别检测小鼠颌下腺及外周血Th17、Treg亚群的比例,分析IL-35处理后对颌下腺组织、外周血中Th17/Treg比例的影响;应用逆转录定量聚合酶链式反应（RT-q PCR）法检测颌下腺中JAK/STAT通路相关基因的表达:与Th17分化发育相关的IL-6/JAK2/STAT3通路基因（IL-6、IL-6r、JAK2、STAT3）,与Treg分化发育相关IL-2/JAK3/STAT5通路基因（IL-2、IL-2rα、IL-2rβ、JAK3、STAT5）,探索相应信号通路基因是否在NOD/Ltj小鼠中参与发病机制,以及IL-35对相应通路基因表达的影响;应用免疫印迹（Western Blotting）方法检测颌下腺中JAK/STAT通路相关蛋白表达:与Th17分化发育相关的IL-6/JAK2/STAT3通路蛋白（IL-6、IL-6r、JAK2、P-JAK2、STAT3、P-STAT3）,与Treg分化发育相关的IL-2/JAK3/STAT5通路蛋白（IL-2、IL-2rα、IL-2rβ、JAK3、P-JAK3、STAT5、P-STAT5）,探索相应的JAK/STAT信号通路是否在NOD/Ltj小鼠中参与发病机制,以及IL-35对相应信号通路的作用。2.第二部分ICR小鼠10只及NOD/Ltj模型小鼠40只,磁珠分选各组小鼠脾脏CD4+T细胞,分选后的CD4+T细胞分成5组:C为ICR空白对照组,M为NOD/Ltj模型对照组,（IL-35 I,IL-35 II和IL-35 III）+M为NOD/Ltj小鼠脾脏CD4+T细胞培养中加入IL-35含量分别为25 ng/m L、50 ng/m L和100 ng/m L。将新鲜分离提取的CD4+T细胞用T细胞培养基重悬,加入抗CD3单抗、抗CD28单抗与不同浓度的IL-35共培养后,分别在24、48、72小时进行以下检测:RT-q PCR法检测Th17细胞的特异性转录因子——维甲酸相关孤核受体转录因子（RORγt）,Treg细胞的特异性转录因子——叉头状家族转录因子（Foxp3）;FCM检测Th17细胞、Treg细胞比例;在体外从细胞水平分析IL-35与调节Th17/Treg比例的关系,并寻找IL-35发挥最佳调节Th17/Treg比例的浓度及作用时间。3.第三部分（1）ICR小鼠10只及NOD/Ltj模型小鼠80只,进行脾脏CD4+T细胞磁珠分选（方法同第二部分）,分选后的CD4+T细胞体外培养,分成六组:C为ICR阴性对照组;M为NOD/Ltj模型对照组;IL-35+M组加入IL-35 100 ng/m L;IL-6+M组加入IL-6 100 ng/m L;IL-6+JSI-124+M组加入IL-6 100 ng/m L,JSI-124（0.5μmol/L）;IL-6+IL-35+M组加入IL-6 100 ng/m L,IL-35 100 ng/m L。共培养72 h后,RT-q PCR法检测RORγt m RNA水平;FCM检测Th17细胞的比例;Western Blotting方法检测JAK2/STAT3信号通路蛋白的表达;探寻IL-35对Th17的调节作用是否通过IL-6介导的/JAK2/STAT3信号通路来实现,并应用该信号通路的特异性阻断剂JSI-124进行验证。（2）小鼠脾脏CD4+T细胞磁珠分选与上述相同方法,分选后的CD4+T细胞体外培养,分成六组:C组、M组、IL-35+M组同（1）;IL-2+M组加入IL-2100 ng/m L;IL-2+AG490+M加入IL-2 100 ng/m L,AG490（50μmol/L）;IL-2+IL-35+M组加入IL-2 100 ng/m L,IL-35 100 ng/m L。共培养72 h后,RT-q PCR法检测Foxp3 m RNA水平;FCM检测Treg细胞的比例;应用Western Blotting方法检测参与Treg分化的JAK3/STAT5信号通路蛋白的表达;探寻IL-35对Treg平衡的调节作用是否通过IL-2介导的JAK3/STAT5信号通路来实现,并应用该信号通路的特异性阻断剂AG490进行验证。结果:1.NOD/Ltj小鼠体重逐渐下降,饮水量逐渐增加,唾液量明显减少,IL-35处理组与剂量相关能够明显改善上述症状。NOD/Ltj小鼠颌下腺指数明显降低及脾脏指数升高显著,IL-35处理组与剂量相关能够明显升高颌下腺指数、降低脾脏指数。病理学显示NOD/Ltj小鼠颌下腺组织淋巴细胞浸润明显,IL-35处理组与剂量相关能够明显减少颌下腺的淋巴细胞浸润。多重免疫荧光结果发现NOD/Ltj小鼠颌下腺Th17细胞比例升高,Treg细胞比例下降;IL-35处理组与剂量相关能够下调Th17细胞比例,上调Treg细胞比例。ELISA检测发现NOD/Ltj小鼠外周血中细胞因子IL-17与IL-6水平升高,IL-10与IL-2水平降低;IL-35处理组与剂量相关能够降低IL-17、IL-6水平,升高IL-10与IL-2水平。FCM法检测检测外周血Th17、Treg细胞比例显示,NOD/Ltj小鼠外周血Th17细胞比例升高,Treg细胞比例下降,IL-35处理组与剂量相关能够下调Th17细胞比例,上调Treg细胞比例。RT-q PCR结果显示:NOD/Ltj小鼠颌下腺中与Th17细胞分化相关的IL-6/JAK2/STAT3通路相关基因（IL-6、IL-6r、JAK2、STAT3）表达明显上调,IL-35处理组与剂量相关能够明显下调上述基因的表达;与Treg细胞分化相关的IL-2/JAK3/STAT5通路相关基因（IL-2、IL-2rα、IL-2rβ、JAK3、STAT5）表达明显下调,IL-35处理组与剂量相关能够明显上调上述基因的表达。Western Blotting结果显示:NOD/Ltj小鼠颌下腺中与Th17细胞分化相关的IL-6/JAK2/STAT3通路蛋白（IL-6、IL-6r、P-JAK2、P-STAT3）表达明显上调,IL-35处理组与剂量相关能够明显下调上述蛋白的表达;NOD/Ltj小鼠颌下腺中与Treg细胞分化相关的IL-2/JAK3/STAT5通路蛋白（IL-2、IL-2rα、IL-2rβ、P-JAK3、P-STAT5）表达明显下调,IL-35处理组与剂量相关能够明显上调上述蛋白的表达。2.NOD/Ltj小鼠脾脏CD4+T细胞与不同浓度的IL-35进行24 h、48 h和72 h培养,发现在细胞培养72 h,IL-35浓度100ng/m L时下调RORγt m RNA表达量、Th17细胞比例,上调Foxp3 m RNA表达量、Treg细胞比例的作用最显著（P＜0.01）。3.（1）NOD/Ltj小鼠脾脏CD4+细胞在共培养72 h时,IL-6激活JAK2/STAT3通路,上调RORγt表达,升高Th17细胞比例,加入JAK2/STAT3通路阻断剂JSI-124后,IL-6上述作用明显减弱,提示IL-6通过JAK2/STAT3通路上调RORγt表达,升高Th17细胞比例;IL-35与IL-6、NOD/Ltj小鼠脾脏CD4+细胞共培养后,能明显抑制JAK2/STAT3通路的激活,下调RORγt m RNA表达,降低Th17细胞比例,表明IL-35能通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路抑制RORγt的表达,抑制Th17细胞的分化增殖,下调Th17细胞比例。（2）NOD/Ltj小鼠脾脏CD4+细胞在共培养72 h时,IL-2能激活JAK3/STAT5通路,上调Foxp3 m RNA表达,升高Treg细胞比例,加入JAK3/STAT5通路阻断剂AG490后,IL-2上述作用明显减弱,提示IL-2通过JAK3/STAT5通路上调Foxp3的表达,升高Treg细胞比例;IL-35与IL-2、NOD/Ltj小鼠脾脏CD4+细胞共培养后,能明显激活JAK3/STAT5通路,上调Foxp3 m RNA表达,升高Treg细胞比例,表明IL-35能通过增强IL-2/JAK3/STAT5通路促进Foxp3表达,促进Treg细胞的增殖,上调Treg细胞比例。结论:1.IL-35能有效改善NOD/Ltj小鼠外分泌腺的免疫炎症损伤,调节Treg/Th17细胞平衡。2.IL-35调节Treg/Th17细胞平衡的作用呈时间和剂量依赖性。3.IL-35对Treg/Th17细胞平衡的调节可能通过以下机制实现:抑制IL-6/JAK2/STAT3通路下调RORγt的表达,进而抑制Th17的分化增殖;增强IL-2/JAK3/STAT5通路上调Foxp3的表达,进而促进Treg的分化增殖;为SS提供了诊疗新思路。