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目的:失血性休克（hemorrhagic shock,HS）仍是目前全球范围内创伤致死的主要原因之一。HS时因氧供应不足,细胞无氧代谢增加,乳酸、无机磷酸及氧自由基等代谢产物积聚,损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns,DAMPs）大量释放,诱发全身炎症反应,在多种机制共同作用下,失控的全身炎症反应最终导致多器官功能不全发生。其中肺是发生功能不全最早且最多的器官,肺功能不全表现为急性肺损伤（acute lung injury,ALI）或者其严重形式急性呼吸窘迫综合征（Acute respiratory distress syndrome,ARDS）。到目前为止,HS/ALI的发生机制尚未完全阐明,无有效治疗药物,因此亟待对其进行进一步的深入研究。组织因子（tissue factor,TF）与因子VIIa形成TF-VIIa复合物,再与因子X结合,激活因子X（生成Xa）,最终导致凝血酶形成及纤维蛋白沉积。ARDS时肺泡腔内纤维蛋白沉积及肺微血管内血栓生成是其主要病理特征之一。TF不仅参与凝血过程,同时也是全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome,SIRS）的重要参与者。凝血与炎症反应两个系统存在广泛的相互作用,其中一个系统的激活能放大另一个系统的激活。全身TF-凝血酶途径是介导细菌或内毒素诱发的ALI的关键机制。但目前还不清楚全身TF-凝血酶途径是否促进HS/ALI的发生发展。外周血单核细胞是骨髓分化释放入血的一群异质性的吞噬性白细胞,是机体应对炎症反应的主要效应细胞之一。大鼠外周血单核细胞至少分成CD43lo单核细胞(经典单核细胞,对等于人类CD14+单核细胞与小鼠Ly6Chi单核细胞)与CD43hi单核细胞(非经典单核细胞,对等于人类CD14-单核细胞与小鼠Ly6Clo单核细胞)。在稳态下,循环单核细胞可进入脾脏储存。在炎症信号的作用下,骨髓及脾脏储存的单核细胞释放入血,并被迅速趋化至炎症部位发挥作用。单核细胞是感染、移植肺缺血再灌注及机械通气等诱发的ALI/ARDS的主要效应细胞,是ALI/ARDS时炎症风暴及免疫血栓的重要参与者。但目前还不清楚单核细胞是否促进HS/ALI的发生发展。单核细胞是外周血中表达TF的主要细胞。经典单核细胞经刺激物诱导后TF生成增加,而刺激物诱导后非经典单核细胞TF的表达无明显变化。单核细胞激活后提供TF,经外源性凝血途径,可以生成凝血酶。单核细胞源TF→凝血酶途径在细菌或内毒素诱导的ALI的发生发展中起着的至关重要的作用。但目前还不清楚单核细胞源TF→凝血酶途径是否促进HS/ALI的发生发展。创伤/HS大鼠外周血单核细胞数量升高。重度创伤/HS患者极早期单核细胞总体数量及经典单核细胞数量明显升高。创伤/HS大鼠血浆TF升高。因此,单核细胞及单核细胞源TF可能在HS/ALI的发生发展中起着至关重要的作用。丙戊酸（Valproic acid,VPA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂（Histone deacetylase inhibitors,HDACI）。VPA能显著提高致死性HS动物模型的生存率,减轻HS/ALI。VPA能抑制单核细胞表达TF。因此,VPA可能通过抑制单核细胞表达TF,减少凝血酶生成,减轻HS/ALI。TF基因的表达主要在转录水平进行调控。TF基因启动子的Egr-1结合位点介导诱导的单核细胞TF的表达。缺氧是失血性休克的基础病理生理特点,是导致DAMPs释放及全身炎症反应的始作俑者。缺氧诱导Egr-1表达升高,调控单个核吞噬细胞TF表达及肺组织纤维蛋白沉积。而p-ERK1/2调控Egr-1的表达。缺氧刺激使大鼠外周血单个核细胞p-ERK1/2表达升高,诱导TF产生。HS后肺组织p-ERK1/2明显升高。因此,HS可能通过p-ERK1/2→Egr-1途径诱导单核细胞TF表达;VPA抑制p-ERK1/2表达,可能通过抑制单核细胞Egr-1→TF途径,达到减轻HS/ALI的作用。本研究的主要目的是探讨单核细胞及单核细胞源TF在HS/ALI中的作用。并验证VPA是否通过抑制单核细胞源TF表达减轻HS/ALI,并探讨VPA抑制单核细胞TF表达的机制。研究方法:1、单核细胞及单核细胞源TF在HS/SIRS及HS/ALI中的作用研究。体重250-320g的Wistar大鼠麻醉后失血35%总血容量。从失血开始计时,维持HS 30分钟,30分钟后各实验组大鼠给予相应的治疗。大鼠被随机分成五组,每组每个时间点5只（3h和6h）:对照组（control组:仅进行动静脉置管）、失血性休克组（HS组）、去单核细胞+失血性休克组（CL-HS组）、失血性休克+阿加曲班组（HS-ARG组）和失血性休克+VPA组（HS-VPA组,用于第二部分研究,但与该部分研究同步进行）。CL-HS组于建模前24小时尾静脉注射氯膦酸脂质体溶液2ml,其它各组均于实验前24小时尾静脉注射生理盐水2ml。HS-ARG组静脉注射阿加曲班0.5mg/kg（给药容积625μL/kg）,HS-VPA组静脉注射VPA 250mg/kg（给药容积625μL/kg）,其余各组给予相应容积的生理盐水。每个时间点取血液、取肺组织标本。动脉血测PO2,ELISA试剂盒测血清及肺组织TNF-α、IL-1β、MCP-1及IL-6,MDA检测试剂盒测肺组织MPO,肺组织HE染色及ALI评分、免疫组化测肺组织纤维蛋白。control组、HS组和HS-VPA组需另取血3毫升,用大鼠单核细胞分离试剂盒分离单核细胞。荧光定量PCR测TF m RNA,Western Blot测TF,免疫荧光测TF。control组、HS组和HS-VPA组每组每个时间点各增加五只大鼠,取外周血3毫升分离单核细胞用流氏细胞分析法检测单核细胞亚型。2、VPA对HS大鼠单核细胞TF表达、SIRS和ALI的作用研究。与第一部分研究同步进行。整个实验过程已于第一部分阐述。3、VPA对HS大鼠单核细胞TF表达的影响机制的研究。使用第1及第2部分研究中control组、HS组和HS-VPA组分离的单核细胞。荧光定量PCR测Egr-1m RNA,Western Blot测p-ERK1/2与Egr-1。体外培养THP-1细胞用于机制验证。用si RNA敲低THP-1细胞的Egr-1基因,荧光定量PCR检测验证Egr-1 m RNA的敲低效果。THP-1细胞分为五组培养:control组（21%O2）、hypoxia组（1%O2）、PD98059-hypoxia组（1%O2,PD98059为p-ERK1/2抑制剂）、sh-Egr-1-hypoxia组（1%O2,sh-Egr-1表示用si RNA敲低Egr-1基因的THP-1细胞）和hypoxia-VPA组（1%O2）。荧光定量PCR检测各组TF m RNA、Egr-1 m RNA,Western Blot检测TF、Egr-1及p-ERK1/2。目的是验证缺氧刺激通过p-ERK1/2↑→Egr-1↑途径诱导单核细胞表达TF,VPA通过调控p-ERK1/2→Egr-1轴抑制HS诱导的单核细胞表达TF。结果:1、与control组比较,HS组大鼠外周血CD43loHIS48hi单核细胞比率、CD43hiHIS48lo单核细胞比率、CD43loHIS48hi/CD43hiHIS48lo单核细胞之比升高显著;外周血TNF-α、IL-1β、MCP-1及IL-6水平升高显著;肺组织IL-1β、IL-6、MPO水平升高,PO2/FIO2降低,肺泡壁增厚,炎性细胞浸润增多,ALI评分升高。与HS组比较,CL-HS组大鼠外周血内TNF-α、IL-1β、MCP-1及IL-6水平显著降低;肺组织IL-1β、IL-6、MPO水平显著降低,PO2/FIO2升高,肺泡壁增厚程度减轻,炎性细胞浸润减少,ALI评分下降。说明单核细胞是HS/SIRS及HS/ALI的主要效应细胞,CD43loHIS48hi单核细胞对HS/SIRS及HS/ALI的贡献更大。2、与control组比较,HS组大鼠单核细胞TF m RNA及TF蛋白水平明显升高。与HS组比较,HS-ARG组大鼠外周血内TNF-α、IL-1β、MCP-1及IL-6水平显著降低;肺组织IL-6、IL-1β及MPO水平显著下降,PO2/FIO2升高,肺泡壁增厚程度减轻,炎性细胞浸润减少,ALI评分降低。说明HS诱导单核细胞TF表达,抑制全身TF→凝血酶通路,可减轻HS/SIRS及HS/ALI。3、与HS组比较,HS-VPA组大鼠外周血CD43loHIS48hi单核细胞比率、CD43hiHIS48lo单核细胞比率、CD43loHIS48hi/CD43hiHIS48lo单核细胞之比均明显降低,单核细胞TF m RNA及TF蛋白水平显著下降;外周血TNF-α、IL-1β、MCP-1及IL-6水平显著降低;肺组织IL-6、IL-1β及MPO水平显著下降,PO2/FIO2升高,肺泡壁增厚程度减轻,炎性细胞浸润减少,ALI评分显著降低。说明VPA抑制CD43loHIS48hi单核细胞动员及其TF的表达,减轻HS/SIRS及HS/ALI。4、与control组比较,HS组大鼠单核细胞p-ERK1/2,Egr-1 m RNA及Egr-1蛋白、TF m RNA及TF蛋白表达均明显升高。与HS组比较,HS-VPA组大鼠单核细胞p-ERK1/2,Egr-1 m RNA及Egr-1蛋白、TF m RNA及TF蛋白表达均明显下降。说明VPA可能抑制HS时单核细胞p-ERK1/2、Egr-1 m RNA及Egr-1蛋白、TF m RNA及TF蛋白的表达。5、THP-1细胞体外培养结果。与control组比较,hypoxia组p-ERK1/2、Egr-1m RNA及Egr-1蛋白、TF m RNA及TF蛋白表达均明显升高。与hypoxia组比较,PD98059-hypoxia组的Egr-1 m RNA、Egr-1蛋白、TF m RNA及TF蛋白的表达明显降低。与hypoxia组比较,sh-Egr-1-hypoxia组的TF m RNA及TF蛋白表达均明显降低。说明缺氧刺激通过p-ERK1/2↑→Egr-1↑途径诱导单核细胞表达TF。与hypoxia组比较,hypoxia-VPA组p-ERK1/2、Egr-1 m RNA及Egr-1蛋白、TF m RNA及TF蛋白表达均明显下降,说明VPA通过调控p-ERK1/2→Egr-1轴抑制缺氧诱导的单核细胞表达TF。结论:1、单核细胞促进HS/SIRS及HS/ALI的发生发展。2、单核细胞源TF通过促进凝血酶产生,促进HS/SIRS及HS/ALI的发生发展。3、VPA通过调控p-ERK1/2→Egr-1轴抑制HS诱导的单核细胞表达TF,减轻HS/SIRS及HS/ALI。