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肝细胞癌是世界上最常见的肿瘤之一。因为其恶性进展快且极易发生转移和复发，导致治疗难度大，死亡率高，世界范围内致死率排名第三，对百姓健康和家庭危害极大。免疫球蛋白超家族成员CD147分子是早期我们教研室筛选鉴定的肿瘤相关抗原。作为单次跨膜糖蛋白，CD147存在三个糖基化位点：Asn44、Asn152、Asn186，可以形成高糖基化形式(HG，~43–66kDa)和低糖基化形式(LG，~35kDa)，它在肝细胞癌等多种恶性肿瘤中高表达，是重要的药物靶点。CD147分子通过多种不同的机制促进肿瘤细胞生长代谢，浸润转移，血管生成，死亡抵抗及耐药等生物学行为，在肿瘤进展中发挥重要的作用。大量的蛋白质组学研究结果表明CD147分子具有两个磷酸化位点：分别位于胞内段的第246、252位丝氨酸。也有研究表明在前列腺癌细胞中，CD147磷酸化位点为S252，并与细胞的增殖有关。那么，CD147分子在肝细胞癌中是否存在磷酸化？如果有，其磷酸化位点又是什么？有何生物学意义？目前未见报道。本课题通过解决以上问题来帮助我们进一步了解CD147在肝细胞癌进展中发挥的重要功能及其分子机制，并为基于CD147分子的肝癌靶向治疗提供新的思路。
本课题主要包括三个部分：
第一部分：CD147磷酸化位点的研究
首先通过HE染色将组织区分为癌与癌旁组织，而后进行免疫组织化学染色，我们发现在肝细胞癌与癌旁组织中均有CD147分子表达。根据此结果，我们构建原位邻位连接技术(Proximity Ligation Assay，PLA)，检测组织中CD147分子的丝氨酸磷酸化修饰(p-Ser)，结果表明在肝癌与癌旁组织中CD147存在丝氨酸磷酸化修饰。提取HUH-7肝癌细胞中CD147蛋白并进行质谱分析，结果显示CD147可能的磷酸化位点为S246。结合文献，构建WT、S246A、S252A、S246A/S252A四株HUH-7稳转细胞系，免疫印迹实验检测确认各株细胞CD147蛋白表达量一致。而后使用放线菌酮处理细胞，确认了各株细胞CD147蛋白的稳定性没有受影响。根据以上结果，我们使用免疫沉淀方法收集了各株细胞中的CD147蛋白并对p-Ser进行检测，结果提示S252A、S246A/S252A两株细胞CD147磷酸化水平显著降低。为再次印证该结果，我们使用PLA技术对4株细胞进行CD147的p-Ser检测，结果显示S252A、S246A/S252A两株细胞未检测到PLA信号，S246A细胞PLA信号减弱。因此，在HUH-7细胞中CD147蛋白的主要磷酸化位点为S246和S252。
第二部分：CD147磷酸化功能的研究
为明确CD147磷酸化修饰的生物学功能，我们首先对构建的WT、S246A/S252A两株细胞进行了实时细胞分析(RTCA)，结果说明去磷酸化的CD147分子增强了肝癌细胞的增殖能力。为再次验证该结果，对两株细胞进行了CCK8实验，得到了与RTCA一致的结果。我们实验室之前的研究表明，CD147分子与肝细胞癌侵袭转移有关，那么CD147磷酸化对细胞的侵袭转移能力是否有影响？随后我们对WT、S246A/S252A两株细胞进行了划痕实验，结果表明去磷酸化的CD147分子增强了肝癌细胞的运动能力。Transwell实验结果提示去磷酸化的CD147分子增强了肝癌细胞的侵袭能力。基于以上结果，我们利用PLA技术检测了76例肝细胞癌患者肿瘤标本中CD147磷酸化修饰表达水平与临床资料的的相关性。结果表明CD147磷酸化修饰低水平表达与肝癌病人的远处转移、血清AFP、复发显著相关。在CD147蛋白表达水平一致的情况下，发生远处转移的肝癌组织中CD147的磷酸化修饰水平显著低于未发生转移的肝癌组织中的表达。Kaplan-Meier分析显示CD147磷酸化表达较低的患者生存率显著降低。因此，CD147蛋白磷酸化低表达可以促进肝细胞癌的远处转移并预示着不良预后。
第三部分：CD147蛋白激酶及相关信号通路的研究
我们明确了在HUH-7细胞中CD147的主要磷酸化位点为S246和S252，然而两个位点对应的磷酸激酶尚不明确。结合文献报道与CD147的氨基酸序列，我们预测S252的丝氨酸磷酸激酶为Nek6。通过下调Nek6的表达水平，我们发现CD147蛋白表达并没有改变，但是其磷酸化水平显著下降。进一步应用免疫共沉淀实验，我们明确了Nek6是CD147可能的互作分子。前期的研究表明CD147可以调节STAT3、Akt、C-jun等信号通路从而促进肿瘤的增殖、侵袭转移。在本研究中我们发现：CD147的磷酸化修饰能够负向调控STAT3、Akt的活性。
综上所述，我们的研究发现CD147分子的主要磷酸化位点为Ser246和Ser252，Ser252磷酸激酶为Nek6；去磷酸化的CD147分子通过影响PI3K/Akt信号通路的活化，进而促进肝细胞癌的增殖、侵袭和转移。
本课题主要包括三个部分：
第一部分：CD147磷酸化位点的研究
首先通过HE染色将组织区分为癌与癌旁组织，而后进行免疫组织化学染色，我们发现在肝细胞癌与癌旁组织中均有CD147分子表达。根据此结果，我们构建原位邻位连接技术(Proximity Ligation Assay，PLA)，检测组织中CD147分子的丝氨酸磷酸化修饰(p-Ser)，结果表明在肝癌与癌旁组织中CD147存在丝氨酸磷酸化修饰。提取HUH-7肝癌细胞中CD147蛋白并进行质谱分析，结果显示CD147可能的磷酸化位点为S246。结合文献，构建WT、S246A、S252A、S246A/S252A四株HUH-7稳转细胞系，免疫印迹实验检测确认各株细胞CD147蛋白表达量一致。而后使用放线菌酮处理细胞，确认了各株细胞CD147蛋白的稳定性没有受影响。根据以上结果，我们使用免疫沉淀方法收集了各株细胞中的CD147蛋白并对p-Ser进行检测，结果提示S252A、S246A/S252A两株细胞CD147磷酸化水平显著降低。为再次印证该结果，我们使用PLA技术对4株细胞进行CD147的p-Ser检测，结果显示S252A、S246A/S252A两株细胞未检测到PLA信号，S246A细胞PLA信号减弱。因此，在HUH-7细胞中CD147蛋白的主要磷酸化位点为S246和S252。
第二部分：CD147磷酸化功能的研究
为明确CD147磷酸化修饰的生物学功能，我们首先对构建的WT、S246A/S252A两株细胞进行了实时细胞分析(RTCA)，结果说明去磷酸化的CD147分子增强了肝癌细胞的增殖能力。为再次验证该结果，对两株细胞进行了CCK8实验，得到了与RTCA一致的结果。我们实验室之前的研究表明，CD147分子与肝细胞癌侵袭转移有关，那么CD147磷酸化对细胞的侵袭转移能力是否有影响？随后我们对WT、S246A/S252A两株细胞进行了划痕实验，结果表明去磷酸化的CD147分子增强了肝癌细胞的运动能力。Transwell实验结果提示去磷酸化的CD147分子增强了肝癌细胞的侵袭能力。基于以上结果，我们利用PLA技术检测了76例肝细胞癌患者肿瘤标本中CD147磷酸化修饰表达水平与临床资料的的相关性。结果表明CD147磷酸化修饰低水平表达与肝癌病人的远处转移、血清AFP、复发显著相关。在CD147蛋白表达水平一致的情况下，发生远处转移的肝癌组织中CD147的磷酸化修饰水平显著低于未发生转移的肝癌组织中的表达。Kaplan-Meier分析显示CD147磷酸化表达较低的患者生存率显著降低。因此，CD147蛋白磷酸化低表达可以促进肝细胞癌的远处转移并预示着不良预后。
第三部分：CD147蛋白激酶及相关信号通路的研究
我们明确了在HUH-7细胞中CD147的主要磷酸化位点为S246和S252，然而两个位点对应的磷酸激酶尚不明确。结合文献报道与CD147的氨基酸序列，我们预测S252的丝氨酸磷酸激酶为Nek6。通过下调Nek6的表达水平，我们发现CD147蛋白表达并没有改变，但是其磷酸化水平显著下降。进一步应用免疫共沉淀实验，我们明确了Nek6是CD147可能的互作分子。前期的研究表明CD147可以调节STAT3、Akt、C-jun等信号通路从而促进肿瘤的增殖、侵袭转移。在本研究中我们发现：CD147的磷酸化修饰能够负向调控STAT3、Akt的活性。
综上所述，我们的研究发现CD147分子的主要磷酸化位点为Ser246和Ser252，Ser252磷酸激酶为Nek6；去磷酸化的CD147分子通过影响PI3K/Akt信号通路的活化，进而促进肝细胞癌的增殖、侵袭和转移。