脑损伤是神经外科常见疾病,包括脑出血,脑梗塞,脑创伤等。其发病率以及致死、致残率均较高,是危害人民健康的主要疾病。急性脑损伤后的神经元损伤可有两种,一种是物理,化学等因素直接作用于神经元导致的原发性神经元损伤。另一种为迟发性脑损伤,主要是原发性损伤导致的缺血缺氧引起。我们知道,脑损伤病人救治过程中除了抢救时间要快之外,更重要的工作是如何保护损伤后的脑组织,阻止继发性脑损害的进一步发生发展。以往研究认为脑损伤后的缺血缺氧产生大量的氧自由基是造成继发性脑损伤的主要原因。但是目前对自由基清除剂的临床应用尚无充足的证据证明有效。迄今为止,全世界神经科学家、临床医师和药厂都在通力合作,力争把通过长期实验研究发现的大量能够促进脑损伤后神经功能恢复的药物,逐步过渡到临床应用研究。国外学者已经采用医学循证方法,将200多种脑损伤后的脑保护药物用于治疗急性脑损伤病人,但未能发现任何一种临床有效的药物,其中包括现今临床常用的自由基清除剂。低氧诱导因子1α(HIF-1α)是近年来研究的热门,其在脑梗塞和脑出血时均有表达。是脑损伤时对缺血缺氧反应的关键基因,已经证明其调控的下游基因多达70个之多。我们应用MCAO方法制作稳定的脑损伤模型来研究HIF-1α在脑损伤后脑保护中的作用。我们发现,应用NAC, Edaravone等自由基清除剂确实可以减轻脑损伤,但是该脑神经保护作用可被HIF-1α抑制剂YC-1.2ME2等所阻断。这说明自由基清除剂NAC等的脑神经的保护作用机制与HIF-1有关,HIF-1α通路在脑损伤后的脑保护方面起关键作用。脑损伤时,HIF-1α信号转导通路与改善脑组织血供、减轻脑组织缺血缺氧损伤密切相关,可能是脑损伤后脑保护治疗的新分子靶位,这为寻找治疗脑损伤后脑保护药物开辟了新的研究方向,具有十分重要的理论价值和临床意义。同时我们也进行了HIF-1α脑保护作用时间窗的研究,并对HIF-1α在脑损伤后BBB保护作用方面进行了初步研究。本实验主要分五个部分：第一部分大鼠MCAO脑损伤模型的建立目的介绍一种较为简单的脑缺血损伤模型的建立方法并在此基础上进行脑损伤的评价。方法取270-310gSD大鼠,应用异氟醚(Isoflurane)气体吸入麻醉,在手术显微镜下,经颈部正中切口,暴露右侧颈内动脉,颈外动脉及颈总动脉。暂时阻断颈总动脉和颈内动脉血流,在颈外动脉上切一小口,将末端直径为0.35mm的线栓插入颈内动脉离颈外动脉分叉处18-20mm,阻塞大脑中动脉90分钟后再次麻醉并显微镜下取出线栓。24小时后进行神经功能评分并进行MRI扫描评价脑水肿和脑损伤面积。磁共振扫描后取脑组织并超薄切片进行TTC染色。结果该方法制作的脑损伤面积基本一致。大鼠MCAO后的神经功能障碍评分表明存在明显的神经功能障碍。损伤的大鼠均出现较为一致的神经功能缺损,大鼠的死亡率为0,24小时后的MRI扫描发现脑水肿明显,脑损伤面积与文献报道一致。TTC染色同样表明成功阻塞大脑中动脉供血范围,大脑中动脉供血范围内有明显缺血表现结论大鼠大脑中动脉阻塞损伤模型操作简便,重复性好,能模拟脑损伤后神经元缺血损伤过程,可控制损伤程度;是一种较好的动物神经元缺血损伤模型。第二部分Hif-1α抑制剂在动物实验中对脑损伤的作用目的研究大鼠急性脑损伤后HIF-1α抑制剂对大脑皮层HIF-1α的基因表达变化与其抑制神经保护的作用。方法SD大鼠随机分为单纯损伤组、HIF-1α抑剂YC-1处理组2ME2处理组共3组,大脑中动脉阻塞法制作MCAO脑缺血损伤模型,处理组大鼠在损伤前30分钟经股静脉插管注射等量DMEO或YC-1 2mg/kg、2ME2 5mg/kg;单纯MCAO组大鼠、处理组大鼠在缺血再灌注24小时后进行神经功能评分。MRI扫描并断头取脑进行脑组织TTC染色测定脑缺血面积和HIF-1α基因表达的研究。结果单纯脑损伤组和HIF-1α抑制剂组MRI扫描均有脑水肿,其中脑损伤面积以HIF-1α抑制剂组为最大,相对于单纯手术组其脑缺血脑梗死面积和脑组织水含量均明显增加(P<0.05)。TTC染色进行的脑缺血面积检测也显示在单纯手术组同HIF-1α抑制剂处理组相比较,YC-1处理组和2ME2处理组脑缺血面积有明显的增加(P<0.05)。神经功能评分在单纯手术组和HIF-1α抑制剂处理组比较有显著性差异(P<0.05)。HIF-1α抑制剂组间无明显差异。伤后24 h HIF-1α基因的表达在单纯手术组HIF-1α均有表达。在HIF-1α抑制剂应用组,HIF-1α的表达均未检测到。说明HIF-1α抑制剂的应用很好的抑制了脑损伤后HIF-1α的表达。结论HIF-1α在脑损伤后表达水平明显增加,说明HIF-1α参与脑损伤后的继发性神经元损伤保护,其表达抑制剂YC-1和2ME2可明显加重损伤大鼠预后,说明HIF-1α对急性脑损伤具有保护性治疗作用。第三部分：抗氧化剂上调HIF-1α的表达并减少缺血导致的脑损伤目的研究大鼠脑皮层神经元缺血性损伤后HIF-1α的表达及氧自由基清除剂NAC和Edaravone的保护作用。方法SD大鼠分三组,一组为单纯的MCAO组,一组为NAC治疗组,NAC150mg/kg经腹腔注射于MCAO前30分钟注射,一组为Edaravone治疗组,Edaravone 5mg/kg经腹腔在MCAO前30分钟注射。每一组大鼠脑缺血90分钟后取出线栓再灌注24小时。24小时后行神经功能评分(Neurological Scores)和MRI扫描检查脑损伤程度。然后取脑组织进行TTC染色监测脑缺血面积。并应用Western Blot方法检测脑缺血损伤后大鼠大脑皮质的HIF-1α的表达水平。结果MRI和TTC染色结果均显示应用NAC和Edaravone等自由基清除剂后脑损伤程度明显的减轻。和对照组单纯MCAO模型相比较,其梗塞面积和缺血面积均明显的减少(P<0.05)。神经功能评分在应用自由基清除剂组也有明显的改善。Western blot检测结果显示HIF-1α在未损伤皮层神经元无可显示的表达;但是在大脑中动脉阻塞侧HIF-1α损伤后24小时表达明显升高(P<0.05),而在应用了抗氧化剂组,HIF-1α的升高更加明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠MCAO脑缺血损伤后HIF-1α在脑皮层表达明显增强,应用抗氧化剂NAC或Edravone后脑损伤面积明显减少,HIF-1α表达较对照组蛋白表达水平增加明显。抗氧化剂在大鼠缺血脑损伤模型中有显著的神经保护作用,其保护作用与HIF-1α的表达增加有关。第四部分HIF-1α对缺血导致的脑损伤的保护作用时序性研究目的利用脑缺血损伤模型来进行HIF-1α神经保护性作用时间窗的研究。为进一步指导临床治疗建立基础。方法利用MRI可以活体检测脑损伤程度的优势,于大鼠大脑中动脉阻塞90分钟后再灌注0小时,3小时,6小时,12小时和24小时分别进行同一只大鼠的MRI扫描,分析脑组织水含量和脑梗塞的面积时序性变化。取270-310gSD大鼠,随机分入对照组或HIF-1α抑制剂(YC-1)应用组。对照组为大脑中动脉阻塞组,在大脑中动脉阻塞前30分钟经股静脉插管注射等量DMEO。YC-1处理组为MCAO加YC-1 2mg/kg于大鼠大脑中动脉阻塞前30分钟经股静脉注射。结果在对照组,大鼠经大脑中动脉阻塞90分钟后脑水肿和脑梗塞面积是缓慢发展的,在0小时,3小时时基本无明显脑水肿和脑梗塞。缺血90分钟再灌注6小时时在大脑中动脉阻塞一侧的皮质下出现了少许梗塞灶,到12小时时,梗塞灶的轮廓已经出现,并保持至24小时,其MRI扫描的梗塞灶的密度不断加深。这说明HIF-1α的保护作用是有时效性的,其作用的时间窗应该是在12小时之前。当脑缺血再灌注12小时后脑梗死的发展已经是不可逆转的了,12小时时的梗死面积基本上就是24小时后的梗塞面积。而在HIF-la抑制剂YC-1处理组,从0-3小时开始,脑梗塞轮廓就已经出现,并保持到24小时后。这说明当没有了HIF-1α的保护作用后,脑缺血损伤很快发生,在大脑中动脉供血区的脑组织由于对缺血缺氧更加敏感而更快和更多的发生了损伤。在MRI扫描图像上表现为梗塞灶轮廓在0-3小时即出现并且梗塞灶轮廓为大脑中动脉供血区的绝大部分。随后随着梗塞区脑神经的坏死,脑梗塞灶的密度在MRI图像上逐渐的增强。结论大鼠大脑中动脉阻塞导致脑缺血损伤后HIF-1α的表达可以保护继发性脑损伤,且其起保护作用的时间窗较短,0-6小时最佳,6-12小时尚有一定的保护作用。12小时后脑损伤灶基本形成,并保持到24小时。当应用HIF-1α抑制剂YC-1抑制HIF-1α的表达,则脑组织对缺血变得更加敏感,容易在缺血后发生继发性损伤。表现为梗塞面积一开始就很大,并且梗塞轮廓出现早,在12小时时大脑中动脉供血区缺血的脑组织即可形成脑梗塞灶。说明HIF-1α脑缺血保护方面具有重要的作用。第五部分脑缺血损伤时HIF-1α对BBB的作用目的应用Evans blue方法和MRI方法来检测脑损伤时HIF-1α对BBB的作用。方法取270-310gSD大鼠,随机分为对照组和YC-1应用组。对照组给与MCAO90分钟后拔出线栓时给予Evans Blue 100mg/kg,经股静脉插管缓慢注射,24小时后测量脑组织内Evans blue含量。HIF-1α抑制剂应用组在MCAO前24小时及半小时给与YC-1 2mg/kg,经股静脉插管注射。MCAO90分钟后拔出线栓时经股静脉插管注射Evans Blue 100mg/kg。再灌注24小时后给与取脑测梗塞侧大脑半球Evans blue含量。另外取270-310gSD大鼠,随机分入对照组和HIF-1α抑制剂应用组。对照组行MCAO90分钟再灌注24小时,在MCAO前30分钟经股静脉插管注射DMSO。24小时后经股静脉插管注射增强药物进行MRI增强扫描,计算血脑屏障通透性(BBB permeability)。HIF-1α抑制剂组在MCAO前24小时和前30分钟经股静脉插管注射YC-1 2mg/kg,24小时后行MRI增强扫描,计算血脑屏障的通透性(BBB permeability)。结果Evans Blue法检测发现,HIF-1α抑制剂应用组的BBB通透性明显的低于对照单纯MCAO组,这说明HIF-1α抑制剂在抑制了HIF-1α的表达后有效的保护了血脑屏障。但是有趣的是在用磁共振增强扫描方法计算的血脑屏障的通透性在HIF-1α抑制剂应用组是增加的,高于单纯MCAO组结论脑损伤后HIF-1α的表达增加可促进大鼠血脑屏障通透性增加。HIF-1α抑制剂由于抑制了脑损伤后HIF-1α的表达,从而使血脑屏障通透性减低,起到了保护血脑屏障的作用。另一方面,应用MRI方法测得BBB通透性在HIF-1α抑制剂应用组是增加的。这与脑水肿在HIF-1α应用组是增加的是一致的。造成这两种BBBpermeability监测结果不一致的原因很多,其中一种是大分子通透性的方法,MRI实际是测验的是小分子的通透性。另一方面,BBB的开放可能存在时序性,用Evans Blue测得是BBB通透性的整体24小时内的结果,而MRI测得的是脑损伤24小时后的BBB通透性时间点上结果。如果HIF-1α对BBB起损伤作用,则可能是由于HIF-1α在不同细胞中的表达水平和所诱导的基因的不同所引起。在神经元中,HIF-1α起一定得保护作用,但在血管内皮细胞和胶质细胞中,HIF-1α的表达增加可能是有害的。这需要进一步的研究。