研究背景骨性关节炎（Ostearthritis OA）是我国四大老年病之一,严重影响老年患者的日常生活,但OA的发病机制至今尚未明确。目前研究资料显示,OA的致病过程中受多方面因素的调控,涉及多种细胞因子,并形成网络级联系统,导致软骨基质降解和软骨细胞凋亡。免疫组化研究显示,人OA软骨细胞较正常软骨细胞高表达基质金属蛋白酶（MMPs）、白细胞介素类（ILs）等细胞因子。白细胞介素18（Interleukin-18,IL-18）是1995年由Okamura等从中毒性休克的小鼠肝脏克隆到了一种由应激诱生的蛋白,该蛋白是一种分子质量为18-19ku的多肽片断,因为该多肽能够诱导辅助性T淋巴细胞产生干扰素-γ（IFN-γ）,还能增强脾T细胞增殖能力及脾NK细胞活性,与白细胞介素12（IL-12）的生物活性极相似,故最初被命名为IFN-γ诱生因子（IFN-γIGIF）。研究表明,IL-18广泛存在于关节炎患者的滑液,滑膜,半月板和软骨细胞中。Gracie在风湿性关节炎的滑液和滑膜中测到的IL-18含量比OA中要高,而OA患者含量又比正常人高。IL-18表达水平与OA活动期关联,提示IL-18可能参与了OA的病因学环节,特别是软骨基质的降解,软骨细胞的凋亡和滑膜的炎性病变过程。IL-18在关节滑膜滑液中通过直接接触T淋巴细胞,使单核细胞产生的TNF-α和IL-1β增加,IL-18诱导产生的IFN-γ在关节液中能显著刺激IL-6,NO,IL-1β,PGE₂,而IFN-γ和TNF-α主要诱导各种炎症疾病包括关节炎的发生和发展。Joosten通过对关节炎滑膜组织中IL-18水平表达的研究表明,其表达与IL-1,TNF-α,局部滑膜炎症程度呈正相关关系,且于疾病急性阶段相平行,这表明IL-18是关节炎病变早期的一种重要细胞因子。由于涉及OA病理过程中的细胞因子不是通过单一的途径发挥作用的,而是彼此交错,相互影响,形成级联反应,因此对单一或少数几个分子的研究有一定的局限性。liquichip workstation液相蛋白芯片系统是一种新型的蛋白质研究平台,可以同时对同一样品中的多个不同的分子进行同时检测,横向比较这些因子间的关联性,有助于筛选出OA相关致病因子,采用液体芯片、xMAP（Flexible Multi-Analyte Profiling）技术进行大量因子表达的测试以研究白细胞介素18结合蛋白对于其他致病因子表达的影响,以研究白细胞介素18和其他因子之间的交互作用,进一步了解其在OA致病机理中的作用机制。研究目的1、观察IL-18和PGE2等细胞因子在OA患者关节滑液中表达的浓度相关性,认识IL-18与PGE2等细胞因子在OA发病机制中的关联,探索IL-18在OA致病过程中的作用,进一步探索IL-18在OA发病机制的分子通路提供线索。2、认识体外细胞培养传代过程软骨细胞形态学的变化,比较正常软骨细胞和OA软骨细胞形态学上的差异。为进一步研究IL-18和细胞因子在OA及正常软骨细胞中的表达选取合适的培养细胞,认识软骨细胞体外培养的去分化现象。3、观察这些细胞因子在正常关节软骨细胞和OA软骨细胞中表达量的差异同时观察IL-18和PGE2等细胞因子在OA软骨细胞上清液中表达的浓度相关性,认识IL-18在OA发病机制中的可能的分子通路节点及交互蛋白,探索OA的病因学。研究方法1、收集OA患者关节液,检测滑液中细胞因子的浓度相关性。取材正常膝关节软骨细胞和OA患者膝关节软骨细胞（需关节置换者）,体外两种软骨细胞培养,使用酶消化法分离接种软骨细胞,并原代培养,使用免疫组织化学,透射电镜观察正常软骨细胞与OA软骨细胞形态学上的差异,软骨细胞传代培养,比较传代软骨细胞之间的形态学差异。2、应用liquichip workstation液相蛋白芯片系统检测原代培养的OA和正常软骨细胞上清液中IL-18和MMP-1,3,9、IL-6,8、TGF-β及VEGF等细胞因子的浓度,通过相关性分析,观察IL-18与其他细胞因子的浓度相关性,筛选出IL-18具有浓度相关性的细胞,为进一步了解IL-18在OA致病机制中分子通路环节环节提供信息。3、统计采用SPSS13.0软件,所测数据以（?）±S表示,组间比较采用成组t检验,并对IL-18和相关因子之间积差法线性相关与回归分析。P＜0.05时差异有统计学意义。结果1、OA患者膝关节滑液中PGE2和IL-18浓度存在正相关关系,IL-18的平均值388.200±107.923pg/mL,PGE2的平均值为152.133±31.716pg/mL。线性相关分析表明,30例患者膝关节滑液IL-18与PGE2呈正相关关系（r=0.621,p=0.000）;OA患者关节滑液中PGE2的含量:决定系数R²=0.386,调整决定系数R_α²=0.364（F=17.608,P=0.0001）表明OA患者关节滑液中PGE2的表达量的变化36.4%可由IL-18的表达量的变化来解释,回归方程是Y=81.248+0.621X。与此同时,IL-6的平均值为2341.636±305.076pg/mL（n=22）;表明IL-6的增高和IL-18存在正相关关系（分别r=0.592,p=0.004）,OA患者关节滑液中IL-6的含量:决定系数R²=0.350,调整决定系数R_α²=0.318（F=10.786,P＜0.05）表明OA患者关节滑液中IL-6的表达量的变化31.8%可由IL-18的表达量的变化来解释,回归方程是Y=1743.435+0.592X;IL-8的平均值为7968.000±2438.823pg/mL（n=9）,表明IL-8的增高和IL-18存在正相关关系（r=0.813,p=0.008）,OA患者关节滑液中IL-8的含量:决定系数R²=0.660,调整决定系数R_α²=0.612（F=13.616,P＜0.05）表明OA患者关节滑液中IL-8的表达量的变化61.2%可由IL-18的表达量的变化来解释,回归方程是Y=2497.809+0.813X。2、OA软骨细胞在细胞贴壁及原代培养上所需时间比正常软骨细胞长。OA软骨细胞从第二代开始就出现长梭状改变,形态学上越来越类似成纤维细胞,随着传代的进行,去分化现在越来越明显,透射电镜下部分OA软骨细胞呈调亡状态,正常软骨细胞胞体呈类圆形;胞核呈圆形或椭圆形,显色为中等,其周围可见扩张的粗面内质网;胞质内可见糖原颗粒。OA软骨细胞胞体减小,其周围有大量皱褶形成;胞核增大且显色深,呈多角形,伴有切迹形成;胞质中粗面内质网和糖原颗粒比较少见。S-100蛋白行免疫组化鉴定可见阳性细胞（加有一抗）胞质浓染,呈红褐色;阴性（不加一抗）软骨细胞内胞质着色淡。3、原代培养的软骨细胞（正常软骨细胞和OA软骨细胞）上清液中,正常软骨细胞IL-18表达水平比较低（16.753±6.087pg/ml）,其他重要致病因子PGE2（30.630±9.620pg/ml）、IL-6（21.90±6.874pg/ml）表达也很低,IL-8表达量（未测到,cut值15.6pg/ml）未能检测到;OA软骨细胞中表达IL-18（79.04±41.061pg/ml）的水平高于正常软骨细胞的表达水平（t=-0.452,p=0.0000）;PGE2（110.082±15.88pg/ml）表达也大大高于正常软骨细胞的表达水平（t=-12.834,p=0.0000）;IL-6（221.63±57.754pg/ml）表达也高于正常软骨细胞的表达水平（t=10.302,p=0.0000）;IL-8（113.198±53.583pg/ml）表达也大大高于正常软骨细胞的表达水平（t=-6.332,p=0.0000）。4、膝OA软骨细胞上清中PGE2与IL-18浓度相互关联,线性相关分析表明,IL-18的表达与PGE2的表达呈正相关关系（r=0.784,p=0.012）,OA患者软骨中PGE2的含量:决定系数R²=0.614,调整决定系数R_α²=0.559（F=11.132,P＜0.05）表明OA患者关节滑液中PGE2的表达量的变化55.9%可由IL-18的表达量的变化来解释,回归方程Y=86.120+0.784X,既随着IL-18含量的增高,PGE2的含量也随之增高;IL-6与IL-18之间也存在浓度相关联,相关分析表明,IL-18与IL-6呈正相关关系（r=0.881,p=0.002）,OA忠者软骨细胞中IL-6的含量:决定系数R²=0.825,调整决定系数R_α²=0.815（F=75.656,P＜0.05）表明OA患者关节滑液中IL-6的表达量的变化81.5%可由IL-18的表达量的变化来解释,回归方程Y=9.868+0.909X;与此同时,线性相关分析表明,IL-18与IL-8浓度之间亦呈正相关关系（r=0.712,p=0.031）,OA患者软骨细胞中IL-8的含量:决定系数R²=0.58,调整决定系数R_α²=0.437（F=7.217,P＜0.05）表明OA患者关节滑液中IL-8的表达量的变化43.7%可由IL-18的表达量的变化来解释,回归方程Y=39.606+0.712X。结论1.OA关节滑液和软骨细胞中IL-18与PGE2、IL-6和IL-8浓度呈正相关关系,提示L-18可能参与关节软骨的基质降解和OA炎症反应,IL-18和PGE2等细胞因子作为参与其中的炎性因子,其分子通路相互交叉,具有密切关联性。2.原代OA软骨细胞中IL-18等炎性细胞因子的表达水平高于正常软骨细胞的表达水平;这说明IL-18等炎性因子参与了OA的病因学环节。3.透射电镜观察发现OA软骨细胞呈调亡改变,软骨细胞从第二代呈现去分化趋势形态学改变,提示基于细胞培养技术的OA病因学研究宜采用原代或第一代软骨细胞。4.liquichip workstation液相蛋白芯片是一种高通量、高敏感性的检测系统,有助于蛋白质组学的研究。