超高压处理对芸豆凝集素活性及结构的影响研究

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芸豆凝集素(Phytohemagglutinin PHA)是一类从芸豆中提取的四聚体糖蛋白。其生理活性具有两面性:一方面,凝集素具有糖结合专一性、α-葡萄糖苷酶抑制活性、诱发人外周血淋巴细胞产生抗癌淋巴因子以及抗HIV病毒等有益的生物学活性,在医药学领域有广泛的应用前景;另一方面,凝集素可以促使红细胞凝集,肠道表面绒毛细胞病变,影响消化和吸收过程,是一类抗营养物质。本文首先对芸豆凝集素的提取工艺、分离纯化工艺进行了优化。然后利用超高压分别处理芸豆匀浆液和分离纯化后的芸豆凝集素样品,对其生理活性、结构特性进行了较为系统的研究分析,得到以下结论:采用两种不同的工艺对四种芸豆中的凝集素进行提取,优化得到最佳的提取工艺,在此基础上采用Affi-gel blue gel亲和柱层析与CM-Sepharose离子交换柱层析分离纯化芸豆凝集素,并利用SDS-PAGE电泳及体积排阻色谱(SEC)检测其纯度。结果表明,中山产红芸豆经过先匀浆再浸提工艺所得凝集素粗品得率最高,凝集活性最强;经过Affi-gel blue gel亲和柱层析与CM-Sepharose离子交换柱层析可以得到较纯的芸豆凝集素样品,但是提取率很低(0.11%),而仅利用Affi-gel blue gel亲和柱层析一步分离纯化也能取得较好的分离效果,有效的富集芸豆凝集素,血凝活性较粗提物的增大16倍,提取率为1.23%。先采用超高压(压力梯度为50MPa、150MPa、250MPa、350MPa和450MPa)对红芸豆匀浆液进行处理,然后对匀浆液中的芸豆凝集素利用Affi-gel blue gel亲和柱层析富集,研究超高压处理对芸豆凝集素血凝活性和结构的影响并分析其构效关系。结果表明:超高压作用可以使芸豆凝集素粗品得率增多但是血凝活性降低。分析富集后的样品,在压力小于450MPa时,芸豆凝集素得率无显著变化,而血凝活性在450MPa时显著降低;电泳图谱和体积排阻色谱图表明在450MPa的压力作用下有高分子量的聚集物生成;红外扫描光谱去卷积分析表明在压力小于450MPa时,β-折叠结构增加、α-螺旋结构减少,在450MPa时无规则卷曲增多且出现大分子聚集。结合热力学特性(SEC图谱)综合分析在压力450MPa以下,芸豆凝集素分子展开,而在450MPa时展开的蛋白分子又重新聚合。先采用Affi-gel blue gel亲和柱层析分离纯化得到芸豆凝集素样品,然后利用超高压(压力梯度为150MPa、250MPa、350MPa和450MPa)直接处理分离纯化后的芸豆凝集素,研究超高压处理对芸豆凝集素血凝活性、糖结合专一性,α-葡萄糖苷酶抑制活性以及糖链结构和蛋白结构的变化。结果表明:纯化后的芸豆凝集素耐压性减弱,在450MPa时,血凝活性基本丧失。糖结合专一性、α-葡萄糖苷酶抑制活性变化不显著,糖染色电泳变化亦不显著,表明超高压作用对芸豆凝集素的糖链结构影响较弱。考马斯亮蓝染色电泳、圆二色谱及DSC图谱共同表明在250MPa以下的压力作用下,芸豆凝集素蛋白结构展开,发生了解离,而在250MPa及以上的压力作用下,芸豆凝集素蛋白结构又开始聚合。
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