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我国是一个乳业大国,然而奶牛乳品质低、乳产量少、发病率高等因素严重限制着我国乳业的进一步发展,如何优化奶牛日粮中的营养配比,尤其是氨基酸的平衡,以及如何提高奶牛乳产量及乳蛋白质(lactoprotein)的含量已经成为我们迫切需要解决的问题。奶牛的氨基酸需要量是营养界一直争论的话题,相对于猪和家禽类,奶牛在应用理想蛋白质(ideal protein, IP)氨基酸模式指导日粮配制的研究方面显得尤为滞后,建立最佳浓度配比氨基酸模式来指导奶牛的日粮配制,已经成为乳业研究者的共同追求。以前的研究主要集中在奶牛日粮中的不同氨基酸浓度对乳产量以及乳蛋白质含量的影响,而以奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary epithelial cells, DCMECs)为模型研究氨基酸调节奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的报道还较少。本课题以泌乳期奶牛乳腺上皮细胞为材料,构建了乳腺上皮细胞的氨基酸饥饿模型(amino acids starvation model),以此饥饿模型为基础,通过营养素和基因互作的方式,研究乳蛋白合成前体物氨基酸与乳蛋白合成关键基因STAT5A的互作关系及其对奶牛乳腺上皮细胞泌乳能力的调节,为优化奶牛日粮的配制提供理论依据。本课题采用胰酶和胶原酶Ⅰ相结合的方法,成功获得体外培养的原代奶牛乳腺上皮细胞模型,并通过免疫荧光、激光共聚焦以及油红染色等方法鉴定了体外培养的奶牛乳腺上皮细胞具有泌乳特性。以传代10次以内的原代细胞为实验材料,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real time PCR, qRT-PCR)方法确定了奶牛乳腺上皮细胞在必需氨基酸(Essential amino acids, EAA)剥夺培养基(EAA-dprivation medium)中的饥饿时间点,构建了奶牛乳腺上皮细胞氨基酸饥饿模型,此时乳腺上皮细胞合成乳蛋白质的含量几乎降为零(p<0.01),通过向饥饿细胞模型中添加单一必需氨基酸,发现蛋氨酸(methionine, Met)、色氨酸(tryptophan, Trp)、亮氨酸(leucine, Leu)、苏氨酸(threonine, Thr)和苯丙氨酸(phenylalanine, Phe)能够诱导8-酪蛋白(beta casein, β-Casein)、αs1-酪蛋白(alphasl casein, asl-Casein)、κ-酪蛋白(kappa casein, K-Casein)的重新合成,其中Met对P-Casein的促进作用最显著,其次是Thr、Trp、Leu和Phe (p<0.01),采用CASY-TT方法检测细胞活力和细胞增殖,发现Met和Leu促进乳腺上皮细胞活力和增殖作用最显著(p<0.01),表明这5种必需氨基酸能够通过调节奶牛乳腺上皮细胞生长状态来影响乳蛋白的合成；同时,采用qRT-PCR方法检测这5种必需氨基酸对泌乳信号通路中关键功能基因mRNA表达量的影响,结果表明,与空白对照组相比,这5种必需氨基酸处理组均能够促进乳蛋白合成重要功能基因mTOR、S6K1、、ELF5和Caveolinl的mRNA表达量上调(p<0.01),揭示这5种必需氨基酸能够通过调节mTOR信号通路、STAT5A信号通路Caveolinl的表达而影响乳蛋白的合成；与空白对照组相比,乳脂合成关键功能基因SREBP1(P<0.01)、乳糖合成关键功能基因AKT1(p<0.01)和GLUT1(p<0.01),细胞增殖关键功能基因CyclinD1(p<0.01)的nRNA表达量均上调,表明这5种必需氨基酸能够通过调节SREBP1和GLUT1的表达来影响奶牛乳腺上皮细胞合成乳脂和乳糖,通过调节CyclinD1的表达来影响乳腺上皮细胞增殖。采用试剂盒检测分泌到培养基上清液中甘油三酯和乳糖的含量,结果显示,与空白对照组相比,甘油三酯(p<0.01)和乳糖含量均升高(p<0.01),表明这5种必需氨基酸能够促进奶牛乳腺上皮细胞合成并分泌乳脂和乳糖。为得到促进乳蛋白合成最佳浓度配比氨基酸模式,根据L18(37)正交表头进行5因素3水平正交试验,筛选出最佳氨基酸浓度配比Met:Leu:Phe:Thr:Trp=158:95:1341:427:228μmol/L。在这个最佳浓度配比氨基酸模式下,细胞活力(p<0.01)和细胞增殖显著增加(p<0.01),表明最佳浓度配比氨基酸模式能够通过促进奶牛乳腺上皮细胞的活力和细胞增殖能力而影响乳腺上皮细胞泌乳。采用qRT-PCR检测最佳浓度配比氨基酸模式对泌乳信号通路关键功能基因mRNA表达量的影响,与空白对照组相比,除了色氨酰tRNA合成酶(TTS)表达量下降外,LeuRS、RARS等其它必需氨基酸的氨基酰tRNA合成酶表达量均上调(p<0.05或p<0.01), mTOR、S6K1、PRLR、JAK2、STAT5A、ELF5、Caveolin D1、SREBP1(p>0.05)、 AKT1、GLUT1和CyclinD1,这些泌乳信号通路相关基因的表达量均上调(p<0.05或p<0.01),表明在最佳浓度配比氨基酸模式下,氨基酸能够通过调节这些信号分子转录水平的基因表达量来影响乳腺上皮细胞中乳蛋白、乳脂和乳糖的合成。采用Western boltting实验方法检测最佳浓度配比氨基酸模式对泌乳信号通路功能基因蛋白质表达量的影响,结果显示,与空白对照组相比,mTOR、p-mTOR、S6K1、p-S6K1、STAT5A、SREBP1、p-AKT1、AKT1、GLUT1和CyclinD1的蛋白表达量均增加(p<0.01或p<0.05),Western blotting实验结果表明,最佳浓度配比氨基酸模式能够通过调节氨基酰tRNA合成酶、mTOR信号通路、STAT5A信号通路来影响乳蛋白合成,通过调节SREBP1的表达来影响乳脂的合成,通过调节AKT1和GLUT1的表达来影响乳糖的合成,通过调节CyclinDl的表达来影响奶牛乳腺上皮细胞增殖。采用试剂盒检测分泌到培养基中的甘油三酯和乳糖的含量,结果显示,与空白对照组相比,甘油三酯和乳糖含量均升高(p<0.01),表明最佳浓度配比氨基酸模式下,能够显著促进奶牛乳腺上皮细胞合成并分泌乳脂和乳糖。分析奶牛乳腺组织中泌乳关键功能基因的表达,并结合奶牛乳腺组织差异基因数字表达谱,筛选出乳蛋白合成重要基因STAT5A作为研究对象,研究不同浓度配比氨基酸模式与STAT5A基因互作关系,及其对奶牛泌乳的调控机制。通过基因沉寂技术,qRT-PCR方法检测STAT5A基因的干扰效率：与阴性对照组相比,转染24h后STAT5A抑制组中STAT5A基因的mRNA相对表达量下调了80%(p<0.01)。采用qRT-PCR方法检测不同浓度配比氨基酸与STAT5A基因沉寂互作对泌乳信号通路关键基因表达量的影响,转染24h后与阴性对照组相比,STAT5A抑制组能够下调STAT5A、SREBP1、GLUT1、Cyclin D1和β-Casein基因mRNA表达量(p<0.05)；与STAT5A抑制组相比,AA2抑制组能够促进SREBP1、Cyclin D1和β-Casein基因mRNA表达量上调(p<0.05),而AA3抑制组中,STAT5A、SREBP1、GLUT1、CyclinD1和β-Casein基因mRNA表达量下调(p<0.05)。采用Western blotting实验方法检测不同浓度配比氨基酸模式与STAT5A基因沉寂互作对泌乳信号通路关键基因表达量变化的影响：转染48h后,与阴性对照组相比,STAT5A抑制组能够使p-STAT5A、STAT5A、SREBP1、GLUT1、 Cyclin D1和3-Casein表达量下调(p<0.05)；与STAT5A抑制组相比,AA2抑制组能够促进SREBP1和CyclinD1表达量上调(p<0.05)而对β-STAT5A、STAT5A和β-Casein表达量影响较小(p>0.05),在3个氨基酸添加组中,SREBP1表达量均上调(p<0.05),在AA3抑制处理组中,p-STAT5A、STAT5A、GLUT1和Cyclin D1表达量下调(p<0.05)。采用试剂盒检测分泌到培养基上清液中甘油三酯和乳糖的含量,转染48h后与阴性对照组相比,STAT5A抑制组中的甘油三酯和乳糖含量均降低(p<0.05)；与STAT5A抑制组相比,AA2抑制组能够促进甘油三酯和乳糖的分泌(p<0.05),而AA1抑制组和AA3抑制组对甘油三酯含量的影响差异不显著(p>0.05)。实验过程中,构建了pEGFP-C1-Stat5α表达载体,转染48h后,qRT-PCR检测STAT5A过表达效率,与阴性对照组相比,STAT5A过表达组中STAT5A基因mRNA的表达量增加了15.5倍(p<0.01)。qRT-PCR检测不同浓度配比氨基酸互作对泌乳信号通路关键基因表达量变化的影响。转染48h后与阴性对照组相比,STAT5A过表达组中SREBP1, GLUT1, Cyclin D1和β-Casein的mRNA表达均有不同程度增加(p<0.05)；与STAT5A过表达组相比,3个氨基酸添加组中SREBP1、GLUT1和Cyclin D1的mRNA表达量均增加(p<0.05),但AA3+Stat5a过表达组中,STAT5A、Cyclin D1和β-Casein的表达量显著下降(p<0.05),而对SREBP1和GLUT1的影响差异不显著(p>0.05)。Western blotting检测STAT5A基因过表达与不同浓度配比氨基酸互作对泌乳信号通路关键基因蛋白水平表达的影响,转染后72h后,与阴性对照组相比,STAT5A过表达组能够显著促进SREBP1, GLUT1, Cyclin D1和β-Casein表达的增加(p<0.05)；与pEGFP-C1-Sitot5α组相比,3个氨基酸添加组中SREBP1、GLUT1和CyclinD1的表达量均增加(p<0.05),但在AA3+Stat5a过表达组中,此时的浓度配比氨基酸模式不能够继续促进STAT5A蛋白的表达,对β-Casein的合成也起到了抑制作用(p<0.05)。采用试剂盒检测分泌到培养基中的甘油三酯和乳糖,结果显示转染后72h后,与阴性对照组相比,STAT5A过表达组中甘油三酯和乳糖的含量都有所上升(p<0.05)；与STAT5A过表达组相比,3个氨基酸添加组中,随着氨基酸浓度的增加,甘油三酯和乳糖的含量也显著增加(p<0.05),但3个氨基酸处理组之间,差异不显著(p>0.05)。以上实验结果为奶牛泌乳的分子营养学提供了有价值的实验基础和理论依据。