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背景近年来,以免疫检查点PD-1/PD-L1阻断为代表的肿瘤免疫治疗快速发展并在多种肿瘤的治疗中获得成功,但是免疫疗法在卵巢癌中的应用收效甚微。免疫浸润不足及抑制性免疫微环境是影响免疫疗法在卵巢癌中发挥作用的关键因素。近几年的研究发现,CDK4/6抑制剂,一种靶向细胞周期蛋白的小分子抑制剂,在抑制肿瘤细胞周期的同时能够影响肿瘤的免疫微环境,包括促进杀伤性T细胞浸润,抑制Treg增殖等作用。联合CDK4/6抑制剂和免疫检查点阻断疗法有望成为治疗卵巢癌的新策略,但是CDK4/6抑制剂对卵巢癌肿瘤微环境的影响及作用机制还不明确,CDK4/6抑制剂与PD-1单抗联合应用能否改善PD-1单抗在卵巢癌中治疗效果不理想的情况,都需要进一步的研究。目的1.明确CDK4/6抑制剂对小鼠卵巢癌是否有治疗作用;2.分析CDK4/6抑制剂对小鼠卵巢癌免疫微环境的影响及可能的机制;3.检测CDK4/6抑制剂联合PD-1单抗对小鼠卵巢癌的治疗作用;4.分析联合治疗发挥作用的可能机制。方法1.使用荧光素酶标记的小鼠上皮性卵巢癌ID8细胞和免疫正常的C57小鼠建立卵巢癌模型;2.通过活体成像监测和生存分析评估CDK4/6抑制剂abemaciclib对小鼠卵巢癌的治疗作用;3.使用流式、免疫组化、TUNEL法检测abemaciclib对ID8肿瘤细胞周期、增殖和凋亡的影响;4.免疫组化法检测abemaciclib处理后肿瘤浸润淋巴细胞密度的变化;5.免疫荧光观察肿瘤浸润淋巴细胞分布特点;6使用流式细胞术全面分析CD8+T细胞、CD4+T细胞、B细胞、树突状细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源抑制细胞占总浸润淋巴细胞的比例和活性;7.PCR芯片检测abemaciclib作用后肿瘤内部细胞因子和趋化因子在m RNA水平表达的情况;8.使用细胞因子芯片在体外检测abemaciclib对肿瘤细胞分泌表型的影响;9.使用Transwell检测abemaciclib对肿瘤细胞上清趋化淋巴细胞能力的影响;10.体内实验检测中和相应的趋化因子对小鼠肿瘤进展的影响;11.活体成像检测abemaciclib联合PD-1单抗对小鼠卵巢癌的抑瘤效果并做生存分析,初步评估联合用药的体内安全性;12.对经联合治疗治愈的小鼠再次注射ID8细胞以检测是否存在免疫记忆效应;13.流式分析联合治疗对CD8+和CD4+T细胞活性及功能的影响;14.活体成像及生存分析检测CD8+T细胞和B细胞清除对联合疗法效果的影响;15.通过KM-plot公共数据库分析CD8+T细胞和B细胞对人卵巢癌预后的意义;16.流式分析B细胞清除对CD8+和CD4+T细胞活性及功能的影响。结果1.活体成像监测和生存分析显示,abemaciclib能够抑制小鼠卵巢癌的进展,延长荷瘤小鼠生存时间;2.abemaciclib可以诱导ID8细胞发生G1/S期阻滞,抑制ID8肿瘤增殖,促进调亡;3.免疫组化分析显示,abemaciclib促进ID8肿瘤中淋巴细胞浸润;4.免疫荧光结果显示abemaciclib治疗后浸润增加的CD3+T细胞和B细胞聚集形成三级淋巴结构;5.流式分析显示:abemaciclib作用后杀伤性T细胞及B细胞活性增加,树突状细胞抗原提呈功能增强,肿瘤相关巨噬细胞群中M1表型相关marker表达增加,M2表型相关marker表达降低;6.PCR芯片分析显示abemaciclib增加了TH1型细胞因子和趋化因子的转录水平;7.细胞因子芯片检测显示抑制剂处理后的ID8细胞分泌更多的CXCL10和CXCL13;8.abemaciclib作用后的ID8细胞上清对CD8+T细胞和B细胞趋化能力更强,并且这种趋化效果可以被CXCL10和CXCL13抗体阻断;9.abemaciclib联合PD-1单抗的抑瘤效果优于单药治疗,联合治疗组的小鼠生存时间最长,析因分析显示abemaciclib和PD-1单抗之间存在协同抗肿瘤效应;10.对经联合治疗治愈的小鼠再次注射ID8细胞,肿瘤生长明显小于对照组;11.流式分析显示联合治疗组的CD8+和CD4+T细胞活性和功能比单药治疗组高;12.使用CD8+T细胞或B细胞的清除抗体都可以影响联合治疗的效果;13.生存分析结果显示,在人卵巢癌中,CD8a高表达和CD19高表达的患者比低表达的患者预后更好;14.流式分析杀伤性T细胞活性,发现B细胞清除首先会影响到CD4+T细胞的活性,并最终引起CD8+T细胞的活性和功能下降。结论1.Abemaciclib在小鼠卵巢癌中有抑瘤作用;2.Abemaciclib能够增加小鼠卵巢癌中的免疫浸润,并促进三级淋巴结构形成,为PD-1单抗发挥作用提供基础;3.Abemaciclib使肿瘤微环境中的抗肿瘤免疫细胞活性增加;4.abemaciclib可以使肿瘤组织分泌更多的TH1型细胞因子和趋化因子,促进免疫细胞的趋化浸润;5.abemaciclib和PD-1单抗在小鼠卵巢中可以发挥协同抗肿瘤作用,这种抗肿瘤作用同时依赖于CD8+T细胞和B细胞。