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研究背景:当前,我国部分城市及地区雾霾天气频发,给当地广大居民健康带来严重威胁。PM2.5（粒径≤2.5μm,PM2.5）是雾霾中的主要有害成分。PM2.5粒径小,其表面负载多种有毒物质,如重金属、多环芳烃、有机碳、病原微生物等,PM2.5可以直接引起肺损伤,进一步引发多种呼吸疾病。细胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）是从细胞脱落或释放的一种“通讯介质”,含有m RNA、mi RNAs及蛋白等多种成分。细胞在不同刺激下,释放的EVs中成分也不相同,从而发挥不同的功能,参与多种病理生理活动的进展。目前,关于PM2.5吸入后,刺激机体产生的EVs是否参与肺损伤的进展尚不清楚。另外,间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）产生的EVs（MSCs-EVs）被报道可以通过免疫调节及抗氧化等作用缓解多种疾病的进展,但其是否可以治疗PM2.5引起的肺损伤尚不清楚,有待探明。研究方法:第一部分:探究PM2.5暴露后,EVs是否参与肺损伤的进展。我们收集所在地区的PM2.5样品,并采用气管滴注的方式,建立PM2.5吸入型肺损伤大鼠模型（0mg/Kg,0.5 mg/Kg,1.5 mg/Kg,2.5 mg/Kg）和肺纤维化模型（连续暴露4周）。收集PM2.5损伤后大鼠和对照组大鼠（PBS处理组）的肺组织样本、肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）及BALF中的EVs（BALF-EVs）。进一步利用PM2.5-BALF-EVs(3×1010)、PBS-BALF-EVs(3×1010)或PBS经气管对大鼠进行处理。在体外,利用PM2.5（50 mg/m L）、PM2.5-BALF-EVs（1×10~9）、PBS-BALF-EVs（1×10~9）或PBS分别处理大鼠二型肺泡上皮细胞（alveolar epithelial cells typeⅡ,ATⅡ）（1×10~6）及肺泡巨噬细胞（NR8383）（1×10~6）。干预结束之后,我们用ELISA法检测细胞上清及BALF中IL-6、TNF-α水平,利用HE染色方法评估大鼠肺组织受损程度,利用ROS染色技术评估肺组织氧化应激水平,利用免疫组织化学染色方法检测肺组织TGF-β1表达水平,利用Masson染色技术评估肺组织纤维化水平,利用透射电子显微镜（transmission Electron Microscope,TEM）观察PM2.5暴露后的肺组织超微结构变化特征以及BALF-EVs外形特征,利用western blotting方法检测BALF-EVs中TSG101、CD63表达水平,q RT-PCR方法检测BALF-EVs中mi R-206、mi R-146a-3p、mi R-32、mi R-34b-5p、mi R-221-3p、mi R-142-3p、let-7a、let-7c、let-7d及mi R-21-3p表达水平。第二部分:探究脂肪间充质干细胞（adipose derived Mesenchymal stem cells,ADSCs）来源的EVs（ADSCs-EVs）是否可以减轻PM2.5暴露引起的肺损伤及肺纤维化改变。我们采用原代培养的方式获取大鼠ADSCs细胞,并利用三系分化诱导实验对ADSCs进行鉴定,采用超高速离心的方式提取ADSCs-EVs。利用气管滴注的方式构建PM2.5吸入型肺损伤模型,PM2.5处理结束后2 h左右,经气管移植ADSCs-EVs(3.0×1010)或PBS（对照）,24 h后,收集大鼠BALF及肺组织备用。体外实验中,我们对ATⅡ及NR8383（1×10~6）细胞进行PM2.5（50 mg/m L）处理后,进一步利用ADSCs-EVs（1×10~9）或PBS（对照）对细胞进行干预。24 h之后,利用ELISA技术检测BALF及细胞上清中炎症因子水平,HE染色技术评估大鼠肺组织病理损伤程度,利用IHC方法评估肺组织TGF-β1水平,利用免疫组织荧光技术评估肺组织中TGF-βRⅠ及TGF-βRⅡ水平,利用Masson染色方法评估肺组织纤维化水平,利用TEM观察ADSCs-EVs形态特征,利用细胞免疫荧光技术检测ATⅡ细胞中SP-C及NR8383细胞中CD68表达情况,利用western blotting方法检测GM130、Alix、TSG101、CD63、Nrf2、TGF-β1、TGF-βRⅠ及TGF-βRⅡ表达水平,利用q RT-PCR方法检测let-7c,let-7d-5p,mi R-98,mi R-7i表达水平。第三部分:评估过表达Nrf2脂肪间充质干细胞（Nrf2-overexpressed ADSCs,Nrf2-ADSCs）来源的EVs（Antioxi-EVs）对PM2.5氧化应激损伤的保护作用。我们利用慢病毒感染的方式在ADSCs中过表达Nrf2基因,并利用流式细胞技术对Nrf2-ADSCs干细胞特性进行检测。利用q RT-PCR及western blotting技术评估Nrf2过表达效率。采用气管滴注的方式构建PM2.5吸入型肺损伤模型,PM2.5处理结束后,经气管分别给予PBS,NC-ADSCs-EVs(NC-EVs,3.0×1010)或Antioxi-EVs(3.0×1010)干预,24小时后,收集BALF及肺组织备用。体外我们对ATⅡ细胞（1×10~6）行PM2.5（50 mg/m L）处理后,进一步分别利用NC-EVs或Antioxi-EVs（1×10~9）干预细胞。干预结束之后,我们利用ROS染色技术、MDA及8-OHd G检测法评估肺组织或细胞氧化应激水平,利用IHC技术评估肺组织Nrf2及SOD1表达水平。研究结果:第一部分:PM2.5处理后,大鼠BALF中IL-6及TNF-α水平升高,BALF细胞中ROS水平上升。HE染色结果显示,PM2.5暴露引起肺组织明显的病理损伤改变。肺组织TEM结果显示,PM2.5暴露后,肺泡上皮细胞表面活性物质减少,线粒体结构受损,板层小体受损（空泡样板层小体增多）。Masson染色结果显示,PM2.5长期暴露后,大鼠肺组织发生明显纤维化改变并伴有TGF-β1表达升高。此外,我们还发现PM2.5暴露可以引起大鼠BALF中EVs水平升高,且PM2.5-BALF-EVs可以引起炎症因子（IL-6、TNF-α）及ROS水平上升,引起细胞凋亡坏死水平升高,引起肺损伤。利用q RT-PCR方法对BALF-EVs中部分mi RNAs表达进行分析,结果显示,相比于PBS-BALF-EVs,PM2.5-BALF-EVs中mi R-206、mi R-146a-3p、mi R-32、mi R-34b-5p、mi R-221-3p、mi R-142-3p水平均升高,而let-7a、let-7c及let-7d水平降低。第二部分:在PM2.5引起的肺损伤模型及肺纤维化模型中,利用ADSCs-EVs行干预后,大鼠BALF中IL-6,TNF-α水平降低,细胞ROS产生减少,肺损伤程度减轻,肺纤维化面积减少。体外实验结果显示,ADSCs-EVs可以上调ATⅡ细胞中Nrf2表达,并减轻PM2.5引起的ROS水平上升。ADSCs-EVs还可以升高NR8383细胞中let-7c水平,从而抑制PM2.5引起的炎症反应。此外,ADSCs-EVs可以上调受体细胞中let-7d-5p水平,进一步下调TGF-βRⅠ表达,减轻肺纤维化改变。第三部分:在ADSCs中感染Nrf2过表达慢病毒后,q RT-PCR及western blotting结果显示ADSCs中Nrf2基因及蛋白表达水平均明显上升。收集Nrf2过表达ADSCs中的EVs（Antioxi-EVs）并对PM2.5处理后的大鼠及细胞进行干预。动物实验结果显示,Antioxi-EVs及NC-EVs均能够降低PM2.5暴露后肺组织中的高ROS水平,但Antioxi-EVs能够更加显著地升高肺组织内Nrf2及SOD1表达,对肺组织ROS的抑制作用也更加明显。细胞实验结果表明,与NC-EVs相比,Antioxi-EVs能够更显著地抑制PM2.5引起的ROS及氧化应激产物（MDA、8-OHd G）的产生,能够更有效地减轻PM2.5诱导的细胞凋亡坏死水平。研究结论:1.PM2.5暴露可以引起明显的炎性损伤及氧化应激损伤。2.PM2.5长期暴露可以引起肺纤维化改变,伴随TGF-β1水平升高。3.PM2.5可以引起BALF中EVs水平升高,并且这些EVs具有诱导炎症因子分泌增多、ROS产生增加,促进细胞凋亡及加重肺损伤的能力,其机制可能与其调控相关mi RNAs异常表达有关。4.ADSCs-EVs可以通过上调巨噬细胞内let-7c水平,促进巨噬细胞向M2型极化,减轻PM2.5引起的炎性损伤。5.ADSCs-EVs可以通过上调肺泡上皮细胞中let-7d-5p表达,抑制TGF-βRⅠ表达,减轻PM2.5引起的肺纤维化改变。6.ADSCs-EVs可以上调Nrf2表达水平,进一步抑制PM2.5引起的氧化应激反应。7.成功在ADSCs细胞中过表达Nrf2基因,并成功提取Antioxi-EVs。相比ADSCs-EVs,Antioxi-EVs具有更好的抗氧化能力,对PM2.5引起的氧化应激损伤具有更好的保护作用。本研究探讨了细胞外囊泡在PM2.5吸入型肺损伤中的作用,初步明确了其可能通过异常调控mi RNAs表达来介导肺损伤进展,这为PM2.5吸入型肺损伤的发病机制提供了新的思路。此外,我们还明确了ADSCs-EVs在保护PM2.5吸入型肺损伤方面的作用,这也为此类肺损伤的保护提供了新的潜在的有效策略。