研究背景和目的急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是由胰腺腺泡细胞内胰酶异常激活而导致胰腺实质自我消化引起的局部炎症反应,约20%轻症急性胰腺炎(mild acute pancreatitis,MAP)可演变为重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)。不同于具有自限性的MAP,SAP是以胰腺组织广泛的炎症反应和坏死为主要特征,具有复杂化和重症化的倾向,短时间内可由局部炎症迅速进展至全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome,SIRS),常可造成心、肺、肾和肠道等损伤进而引发多器官功能衰竭(multiple organ failure,MOF),病死率高达15-30%。其中,SAP相关的心肌损伤(SAP-associated cardiac injury,SACI),又称为“胰心综合征”,是SAP重症化进程中最严重的并发症之一,可表现为心功能异常改变、中毒性心肌炎甚至心力衰竭。目前针对SACI预防和治疗尚无有效的手段,因此积极探索其发生机制以及寻找可靠的防治措施已成为亟待解决的临床问题。业已证实,在SAP病程中,机体炎症反应导致的氧化应激与SACI的发生、发展有着密切的关系。在SAP早期,胰腺腺泡细胞和激活的炎性细胞会释放大量心肌抑制因子(对心肌有毒性作用的一类细胞因子和炎症介质),这些心肌抑制因子会促使心肌细胞释放大量氧自由基,当超过机体对自由基的清除能力时,细胞内的生物大分子(如脂质、蛋白质、DNA等)会迅速被氧化,造成心肌细胞结构和功能的损伤,进而导致心室重构及心功能异常。有学者发现,膜渗透性氧自由基清除剂(tempol)能有效减轻AP大鼠心肌损伤,进一步证实了SACI与氧化应激之间的关系。综上可见,若能减轻SAP机体全身炎症反应及其伴随的氧化应激程度有望成为治疗SACI的有效手段。在SAP早期,机体全身炎症反应可导致腹腔内积聚程度不等的胰腺炎相关性腹水(pancreatitis associated ascitic fluid,PAAF),针对PAAF,我中心前期做了大量的临床及基础研究,证实了通过腹腔穿刺引流(abdominal paracentesis drainage,APD)将PAAF及时引流至体外是SAP治疗过程中一个重要的环节。通过APD将富含多种炎症介质和有毒物质的PAAF及时清除,能够有效减轻机体炎症和氧化应激反应程度,延迟或避免出现多器官功能衰竭,发挥对重要脏器的保护作用。此外,动物实验也证实APD能显著减轻SAP相关的肺和肠粘膜损伤。基于此,我们推测SAP早期实施APD有望对SACI起到明显的治疗作用。研究表明,氧化应激与氧化激酶功能的异常密切相关。据报道,还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶的过度激活不但是机体氧化应激水平升高的重要机制,同时也是病理状态下心血管系统活性氧(reactive oxide species,ROS)产生的主要来源,与心血管疾病的发生、发展密切相关。鉴于SACI与氧化应激之间的密切联系以及多种炎症介质对NADPH氧化酶均有激活作用这一事实,NADPH氧化酶的活化有可能也参与了SAP引起的心肌氧化损伤。因此,我们推测APD有可能通过减轻NADPH氧化酶的活化,减少氧自由基产生进而对心肌组织起到保护作用。如果此推测成立,那么APD又是通过何种途径来减轻NADPH氧化酶激活造成的心肌氧化损伤呢?澄清这些问题将为APD治疗SAP的机制提供新的理论依据。高迁移率族蛋白B1(high mobility group box-1 protein,HMGB1)是一种高度保守的核蛋白,生理状态下主要与核内染色体结合。研究发现,在急性胰腺炎时HMGB1可通过坏死胰腺组织的被动释放以及浸润的单核/巨噬细胞主动分泌到细胞外,因此PAAF中常含有高浓度的HMGB1。而胞外HMGB1作为一种重要的损伤相关分子模式可直接参与胰腺炎炎症级联放大反应及重症化,在胰腺及远位器官损伤中发挥着重要的作用。业已证实,HMGB1能通过作用损伤相关分子模式受体激活NADPH氧化酶,引起细胞内ROS含量增加。而PAAF中高浓度的HMGB1,在被腹膜重吸收后会造成循环中HMGB1浓度的二次升高,进一步激活心肌组织NADPH氧化酶。因此,早期实施APD引流PAAF,是否可以通过减少HMGB1的重吸收降低其循环中的浓度,减轻HMGB1所介导的心肌组织NADPH氧化酶的活化进而发挥心脏保护作用呢?尚需进一步研究。针对以上问题,我们首先采用5%牛磺胆酸钠胰胆管逆行注射制备SAP大鼠心肌损伤模型,并对SAP大鼠实施APD,旨在进行下列研究:1、APD对SACI是否有保护作用;2、NADPH氧化酶激活在SACI中的作用及相关分子机制;3、APD是否能够调控心肌组织NADPH氧化酶表达,减轻氧化应激损伤。此外,在成功建立轻型胰腺炎大鼠模型的基础上,分别将SAP大鼠的PAAF以及中和了HMGB1的PAAF注入轻型胰腺炎大鼠的腹腔内,旨在进一步验证PAAF中HMGB1在SAP病程中的作用,以及APD治疗SACI的相关机制。实验目的、方法与结果第一部分:APD对SAP相关心肌损伤(SACI)的保护作用研究目的:观察APD对SAP大鼠治疗效果及对心肌损伤的保护作用研究方法1.APD对SAP大鼠死亡率的影响采用SD雄性大鼠75只,随机分为假手术组(Sham group)、重症急性胰腺炎组(SAP group)、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组(SAP+APD group),每组25只。通过细针穿刺胆胰管逆行注射5%牛磺胆酸钠制备SAP大鼠模型。在SAP造模成功后,于右下腹置入外接负压引流球的橡胶引流管,腹腔内留置约0.5厘米并于腹壁固定,常规消毒后关腹建立APD模型。假手术组大鼠开腹后翻动胰腺组织数次,并于腹腔内留置一根0.5厘米长橡胶引流管后关腹。术后24小时记录各组大鼠死亡率,收集腹水计量并统计。2.APD对SACI的保护作用采用SD大鼠45只,随机分为假手术组(Sham group)、重症急性胰腺炎组(SAP group)、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组(SAP+APD group),每组15只,造模方法同前。造模后8小时检测心电图,24小时检测心脏超声和动脉血压,完成后处死大鼠,搜集腹水、血清、心脏组织,检测:HE染色观察心肌组织病理改变并做病理评分,计算心肌组织干湿重比,Elisa法检测血清心肌酶谱、TNF-α和IL-1β浓度,Tunel法检测心肌细胞凋亡,western blot法检测凋亡相关蛋白的表达。结果:1.造模后24小时,SAP组大鼠死亡率为40.0%,平均腹水量为9.5±1.7ml;SAP+APD组大鼠死亡率为16.0%,平均腹水量为6.5±1.4ml,显著低于SAP组。2.SAP组大鼠心电图出现明显异常,而APD组大鼠心电图偶见异常。此外,与Sham组相比,SAP大鼠心功能明显受损,动脉血压也明显降低。而SAP+APD组与SAP组相比,大鼠心功能的受损情况有明显改善。3.与Sham组相比,SAP组大鼠血清心肌酶谱、淀粉酶活性、TNF-α和IL-1β浓度显著升高;SAP+APD组大鼠上述指标较SAP组明显降低。心肌组织病理学观察及评分:与Sham组相比,SAP组大鼠可见心肌细胞浊肿,伴部分溶解变性,局部区域可见单核细胞浸润,符合早期心肌炎改变,且病理评分和干湿重比值明显增高。SAP+APD组大鼠心肌组织病理改变较SAP组明显减轻,病理评分和干湿比值明显降低。4.SAP组大鼠心肌组织出现明显的细胞凋亡,Bax和Cleaved-caspase-3表达明显升高,Bcl-2表达明显降低。而SAP+APD组大鼠心肌组织细胞凋亡明显减少,促凋亡蛋白与抗凋亡蛋白的失衡明显改善。结论:通过牛磺胆酸钠逆行注射胰胆管的方法能较好的制备SAP大鼠心肌损伤模型。其次,通过实施APD能明显降低SAP大鼠死亡率,减轻心肌组织的病理损伤,改善心脏功能的异常。第二部分:NADPH氧化酶在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究目的:明确NADPH氧化酶在SACI中的作用,证实APD通过调控NADPH氧化酶表达减轻心肌氧化损伤。1.NADPH氧化酶在SACI中的作用研究研究方法(1)体内实验,采用SD雄性大鼠60只,随机分为假手术组(Sham group)、重症急性胰腺炎组(SAP group)、重症急性胰腺炎夹竹桃麻素(apocynin)组(SAP-APO group)和apocynin对照组(APO-CON group),每组15只。SAP-APO组和APO-CON组在造模前30分钟通过大鼠尾静脉注射用10%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解的apocynin(20 mg/kg),而Sham组和SAP组大鼠注射相同体积的DMSO,其余造模方法同前。造模后24小时检测心脏超声,完成后处死大鼠,搜集血清、胰腺和心脏组织,检测:免疫组化和western blot法检测心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达,光度法检测NADPH氧化酶活性,比色法检测氧化应激相关指标,DHE染色检测心肌组织ROS含量,HE染色观察心肌组织和胰腺组织病理变化并做病理评分,Elisa法检测血清心肌酶谱、血清炎症因子和淀粉酶活性,Tunel法检测心肌细胞凋亡,western blot法检测凋亡相关蛋白表达和MAPK信号通路(ERK1/2、JNK、p38)的蛋白表达和磷酸化水平。(2)体外模拟实验,首先用含5%和10%正常大鼠血清或SAP大鼠血清的培养基培养H9C2心肌细胞,采用CCK-8法于干预后3、6、12、24小时检测细胞活力,确定血清的最佳干预浓度和干预时间。接着,将H9C2心肌细胞分为正常大鼠血清组(normal rat serum group,NS)、SAP大鼠血清组(SAP rat serum group,SS)、SAP大鼠血清加apocynin组(SAP rat serum plus apocynin group,SA)和正常大鼠血清加apocynin组(normal rat serum plus apocynin group,NA)。检测:DHE染色检测心肌细胞ROS含量,流式细胞技术检测心肌细胞凋亡,western blot法检测心肌细胞ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平。2.APD对SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶表达的影响采用SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组(Sham group)、重症急性胰腺炎组(SAP group)、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组(SAP+APD group),每组10只,各造模方法同前。造模24小时后搜集心脏组织,检测:western blot法检测心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达,光度法检测NADPH氧化酶活性,DHE染色心肌组织检测ROS含量,比色法检测氧化应激相关指标。结果:1.首先与Sham组相比,SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶蛋白表达和活性均明显增高。与SAP组比较,SAP-APO组大鼠心功能异常明显减轻,血清心肌酶谱浓度、心肌组织病理评分、ROS含量和氧化应激相关指标水平均明显降低,心肌细胞凋亡也明显减少。同时SAP-APO组大鼠与SAP组相比,心肌组织促凋亡蛋白表达明显减少,抗凋亡蛋白表达明显增加,MAPK信号通路ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平也明显降低。而SAP-APO组大鼠胰腺组织病理评分与SAP组相比无显著差异,但血清炎症因子水平有一定程度降低。另外,Sham组与APO-CON组之间无统计学差异。2.在体外模拟实验中,确定用含10%SAP大鼠血清的培养基培养12小时为最佳干预条件。与NS组相比,SS组心肌细胞ROS含量明显升高,细胞凋亡比例明显增加,ERK1/2、JNK、p38的蛋白表达和磷酸化水平也明显升高。SA组与SS组相比,上述指标均有不同程度降低。SS组与NA组之间无显著差异。3.SAP+APD组大鼠心肌组织NADPH氧化酶的蛋白表达和活性较SAP组明显降低,ROS含量明显减少,氧化应激相关指标的水平也明显降低。结论:上述实验结果表明NADPH氧化酶过度激活在SACI中发挥着重要作用,早期实施APD能抑制SAP大鼠心肌组织NADPH氧化酶的异常激活,减轻心肌组织的氧化损伤。第三部分:HMGB1在APD保护SAP相关心肌损伤中的作用研究目的:明确APD通过调控HMGB1降低心肌组织NADPH氧化酶的表达研究方法1.采用SD雄性大鼠30只,随机分为假手术组(Sham group)、重症急性胰腺炎组(SAP group)、重症急性胰腺炎腹腔穿刺引流组(SAP+APD group),每组10只,各造模方法同前。造模24小时后搜集血清、腹水和胰腺组织,检测:Elisa法检测血清胰酶活性以及血清和腹水中HMGB1浓度,HE染色观察胰腺组织病理变化并做病理评分。2.采用SD雄性大鼠36只,通过腹腔连续注射雨蛙素的方法建立轻型胰腺炎大鼠模型,随机分为6组(每组6只):(1)轻型胰腺炎对照组(control group,CN);(2)PAAF注射组(PAAF injection group,PI);(3)PAAF+抗HMGB1中和抗体50ug组(PAAF plus anti-HMGB1 neutralizing antibody 50μg injection group,PIH 50);(4)PAAF+中和抗体100ug组(PIH 100 group);(5)PAAF+中和抗体200ug组(PIH 200 group);(6)PAAF+对照lgY蛋白200ug组(PAAF plus control lgY injection group,PIC)。注射后8小时搜集血清和心脏组织,检测:Elisa法检测血清HMGB1浓度,RT-PCR法检测心肌组织NADPH氧化酶mRNA水平,western blot法检测其蛋白表达。结果:1.与SAP组相比,APD治疗能显著减轻胰腺组织损伤,减少炎性细胞浸润,降低血清胰酶活性和HMGB1浓度。另外,在SAP组大鼠腹水中检测出高浓度HMGB1。2.通过对MAP大鼠腹腔注射PAAF后发现PI组血清HMGB1水平较CN组明显升高,伴Nox-2的m RNA和蛋白表达增高,Nox-4的mRNA表达增高。随着抗HMGB1中和抗体剂量逐渐增加,当中和抗体剂量达到200ug时大鼠血清HMGB1浓度明显降低,Nox-2的mRNA和蛋白表达以及Nox-4的m RNA表达也明显减少。另外,PIC组与PI组之间无明显差异。结论:早期实施APD能显著改善SAP大鼠胰腺的病理损伤,有效减少HMGB1的释放以及重吸收进入血液循环,从而抑制HMGB1介导的心肌组织NADPH氧化酶的表达。全文总结1.在SAP病程中,早期实施APD对SACI具有显著的保护作用。具体表现在降低机体血清心肌酶谱浓度,减轻心肌组织损伤程度,减少心肌细胞凋亡的发生,改善心功能的异常。2.NAPDH氧化酶的过度激活导致心肌组织产生过量ROS是SACI发生的重要机制。大量ROS的产生和堆积会引起心肌细胞凋亡以及MAPK信号通路的激活,造成心功能损害,而抑制NADPH氧化酶的活性能显著减轻SAP导致的心肌损伤程度。3.SAP时,PAAF中高浓度的HMGB1可以通过腹膜重吸收等途径进入机体的血液循环,上调心肌组织NADPH氧化酶的表达。在SAP早期实施APD,通过减少HMGB1释放以及重吸收降低其在循环中的浓度,进而可有效抑制HMGB1介导的NADPH氧化酶信号通路的激活,减轻心肌的氧化损伤,发挥对心肌保护作用(图1)。