【摘 要】
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自噬普遍存在于真核生物细胞中,是细胞新陈代谢重要的生理过程,本文主要研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。本实验采用流式细胞术和CCK8检测了不同浓度
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自噬普遍存在于真核生物细胞中,是细胞新陈代谢重要的生理过程,本文主要研究抑制氧化应激诱导的自噬对猪卵巢颗粒细胞凋亡的作用。本实验采用流式细胞术和CCK8检测了不同浓度的过氧化氢对猪颗粒细胞处理12小时后的凋亡诱导作用和细胞活力的影响,并且对相关凋亡基因做了荧光定量PCR分析。Western blot技术检测微管相关蛋白1轻链3(LC3,包括LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)和自噬相关蛋白P62/SQSTM1的表达量变化,转染GFP-LC3质粒检测自噬体的数量;利用3-甲基腺嘌呤(3-MA)提前4小时抑制自噬后再氧化应激12小时用流式细胞术检测细胞的凋亡率,CCK8检测细胞活力,最后对分子机制做了初步研究,用westemblot检测了氧化应激早期的磷酸化mTOR和磷酸化Foxo1的蛋白水平,用免疫荧光观察氧化应激晚期Foxo1的出入核情况。结果表明氧化应激12小时后,细胞活力随过氧化氢浓度提高显著降低,凋亡率和凋亡基因mRNA表达显著上升。在氧化应激前6小时LC-Ⅱ相对表达量先增加后减少,P62的相对表达量先减少再增加,转染GFP-LC3质粒后发现自噬体数量极显著上调,6小时后显著下降,上述结果表明在氧化应激早期自噬增加,持续氧化应激自噬受到抑制。若提前4小时用3-MA抑制自噬,再用过氧化氢处理12小时,发现抑制自噬后细胞凋亡率较单独氧化应激组显著下降,细胞活力也显著上升,另外氧化应激早期磷酸化mTOR和磷酸化Foxo1表达上调,晚期的Foxo1主要定位在细胞核。本研究证明了氧化应激能诱导猪卵巢颗粒细胞凋亡和早期的自噬,抑制早期的自噬,凋亡率会下降,早期的自噬诱导可能与mTOR和Foxo1二者的磷酸化有关,晚期的颗粒细胞凋亡可能与Foxo1在细胞核的定位有关,这一系列研究发现为提高动物繁殖力和治疗女性生殖疾病提供了理论依据。
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