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牡丹（Paeonia suffruticosa）为芍药属落叶小灌木。是我国的传统名贵花卉之一，主要产于山东菏泽和河南洛阳等地。随着种植年限增加，病原微生物的不断积累，牡丹土传病害有逐年加重的趋势。导致牡丹花的质量与丹皮产量普遍下降的现象。连作障碍现象严重影响丹皮的产量和花的质量和牡丹的产业化。为了探究不同种植年限牡丹根际微生物群落结构变化，从菏泽曹州牡丹园采集4个分别为3、5、8、12年的牡丹根际土壤样品，结合末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）技术与变性梯度凝胶电泳（DGGE）方法研究了样品中细菌和真菌的种群结构变化，探究牡丹连作对土壤微生物种群结构的影响。T-RFLP群落图谱分析表明牡丹的根际土壤中细菌群落结构多样性水平随着牡丹的连作而逐渐降低。牡丹根际细菌种群主要有Firmicutes/Bacilli，Bacteroidetes/Sphingobacteria，Firmicutes/Clostridia，Actinobacteria。用Bio-Dap软件进行了每个样品多样性指数的计算，结果表明牡丹的连作使牡丹根际细菌群落结构趋于简单。对牡丹根际土壤的细菌与真菌DGGE图谱分析表明，各样品间细菌种群结构相似度随着种植年限增加而降低，牡丹根际土壤样品真菌种群结构相似度呈现相同趋势，说明随着种植年限增加牡丹根际微生物种群结构发生较大变化，结构趋于简单，多样性水平逐年降低。对DGGE条带测序结果的分析表明，M1与Halomonas magadiensis（X92150.1）相似性达到98%，M2与Pseudomonas taiwanensis（EU103629.2）相似性达到99%，M6与Flavobacterium daejeonense（DQ222427.1）相似性达到100%，M8与Mesorhizobiummetalliduran（sAM930381.2）相似性达到98%，M9与Cellvibrio gandavensi（sAJ289162.1）相似性达到97%，其它条带为不可培养微生物，上述菌属数量均随着种植年限的增加而逐渐减少。从根际土壤中分离得到300个分离物，以牡丹根腐病病原菌茄腐镰刀菌（Fusariumsolani）为靶标菌，通过平板对峙法筛选到27个具有拮抗性能的菌株，其中MD1，MD4，MD7，MD8，MD64，MD68，MD70具有较强拮抗能力，且拮抗性能稳定。经过形态观察、生理生化特征分析及16S rDNA序列分析。将MD1鉴定为Bacillusamyloliquefaciens，MD4鉴定为Bacillus malacitensis，MD7鉴定为Bacillus subtilis，MD8鉴定为Pseudomonas chlororaphis；MD64鉴定为Streptomyces albireticuli；MD68鉴定为Bacillus tequilensis；MD70鉴定为Bacillus methylotrophicus。它们的16S rDNA序列在GenBank中注册号分别为JN205338、JN205339、JN205340、JN205341、JN205342、JN205343、JN205344。本文结果表明，随着种植年限的增加牡丹根际微生物种类数量发生变化，种群结构趋于简单，一方面微生物多样性水平逐年降低，另一方面某些病原性真菌种群得到富集，微生物群落结构的变化导致牡丹根际微生态结构改变可能是导致老牡丹园区土传病害较严重的主要原因。