背景类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以滑膜炎症、骨和软骨破坏及滑膜组织增生为特征的自身免疫性疾病,其发病机制至今尚未完全明确。近年来,肥大细胞及其合成、分泌的相关细胞因子在RA发病机制中的作用成为研究热点之一。肥大细胞(mast cells,MCs)约占正常关节滑膜细胞总数的3%,其作用可能是参与修复组织损伤或清除病原体;而在RA患者的滑膜组织中,MCs的数量可能是健康人的6~25倍。现有实验研究证实,针刺“足三里”穴具有抗炎、镇痛、免疫调节等作用,在抗RA方面具有良好的应用前景,但其发挥抗炎、免疫调节的分子机制尚未明了,其抗RA的机制是否与调节肥大细胞功能有关有待进一步研究探索。为此,我们针对这一问题进行了一系列实验研究,建立胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,探讨电针“足三里”穴对CIA大鼠的治疗效果及其作用的潜在机制。目的以牛Ⅱ型胶原诱导的关节炎大鼠为模型,从CIA大鼠的足跖肿胀度、关节指数、病理组织形态学改变、炎症因子等方面考察电针“足三里”穴的抗炎及免疫调节作用。通过体内实验观察电针对CIA大鼠治疗作用及对滑膜肥大细胞数目及功能的影响,体外实验评估电针对IL-33诱导的肥大细胞激活的影响,结合mi R-155 mimic转染后的肥大细胞对IL-33刺激的反应性,阐明电针发挥抗胶原诱导性关节炎作用的部分分子机制。方法1.选取清洁级雌性SD大鼠,按数字随机法分为四组,即空白对照组、CIA模型组、CIA模型+电针治疗组、CIA模型+假针刺组,每组30只。常规饲养7天后,除空白对照组外,其余各组大鼠采用牛Ⅱ型胶原与弗氏不完全佐剂的混合乳化液于尾根部皮下注射进行造模,即制作胶原诱导性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型。造模结束后采用关节炎指数对大鼠关节损伤程度进行评分,每两天一次,直至取材前。2.造模结束后,空白对照组、CIA模型组不给予任何干扰,CIA模型+电针治疗组选取“足三里”穴给予电针刺激;其具体参数为:2Hz,1m A,5min;2Hz,1.5m A,5min;2Hz,2m A,20min,以此为一次完整的循环。每天一次,从造模第一天开始持续到取材前一天,一共34天。CI A模型+假电针组大鼠予以针灸针浅刺“足三里”穴但不予通电刺激,其余操作同CIA模型+电针治疗组。每次治疗前均测量各组大鼠体重及足趾肿胀程度,直至取材前一天。末次电针治疗结束后24h,用5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠,后将其置于大鼠板上固定,经腹主动脉取血后离心采集各组大鼠血清。一部分大鼠取其左侧膝关节组织,另一部分大鼠取其左侧滑膜组织,各组织经固定、脱钙、包埋,制成切片;提取大鼠脾脏及分离脾脏单个核细胞;收集无菌腹腔液。实验一1.利用关节炎指数对大鼠关节损伤程度进行评价;称重法测定大鼠体重,足容积法测定大鼠足跖肿胀度;2.HE染色观察膝关节滑膜的组织病理学改变;3.ELISA检测各组大鼠血清中II型胶原抗体(total anti-CII Ig G,anti-CI I Ig G1,anti-CII Ig G2a)及炎性因子(TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-17)的含量;4.流式细胞学检测脾脏淋巴细胞RORγt及IL-17的表达。实验二1.免疫组织化学法检测滑膜组织IL-33的释放;2.ELISA法检测血清中IL-33的含量及滑膜组织中IL-33、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-17的含量;3.实时定量PCR技术检测滑膜组织IL-33m RNA的表达;4.甲苯胺蓝染色显示滑膜组织肥大细胞数目及脱颗粒情况。实验三1.大鼠腹腔肥大细胞的分离及甲苯胺蓝染色鉴定;2.ELISA法检测IL-33刺激肥大细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MC P-1、IL-6、IL-13的分泌及组胺的释放;3.分光光度法测定肥大细胞体外β-己糖胺酶的释放;4.实时定量PCR技术检测IL-33刺激肥大细胞对其ST2及mi R-155表达的影响;5.蛋白质印迹法评价IL-33诱导的肥大细胞NF-κB p65转录及P38 MA PK信号激活情况。实验四1.RT-PCR检测mi R-155 mimic肥大细胞转染后mi R-155表达;2.ELISA法检测IL-33刺激经mi R-155 mimic转染的肥大细胞炎症因子释放;3.蛋白免疫印迹法评价IL-33刺激经mi R-155 mimic转染的肥大细胞NF-κB p65及P38激活情况。结果1.电针足三里减缓大鼠胶原诱导性关节炎(CIA)。CIA模型组大鼠的足趾在造模后逐渐肿胀,肿胀程度于第21天达到峰值,以后逐渐消退;局部皮肤充血、红肿,关节炎评分在第24天达到峰值;体重逐渐减轻。CIA模型+假针刺组大鼠与CIA模型组大鼠的状况表现基本相同。CIA模型+电针治疗组在未治疗前和CIA模型组大鼠状况表现基本相同,经电针治疗后,CIA大鼠足跖肿胀程度减轻(P<0.05)、关节炎评分减小(P<0.05)、体重下降减缓(P<0.05)。HE染色结果显示,与CIA模型组相比,CIA模型+电针治疗组大鼠膝关节滑膜组织增生减轻、炎细胞浸润明显减少(P<0.05)、组织病理学评分明显降低(P<0.05)。ELISA检测结果显示,电针能够不同程度地下调血清中Ⅱ型胶原抗体(总抗CII Ig G抗体浓度、抗CII Ig G1抗体浓度、抗CII Ig G2a抗体)的含量(P<0.01、P<0.05、P<0.01),抑制CIA大鼠血清炎症因子(TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17)的释放(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05)。流式细胞学检测结果表明,电针能够明显下调CIA大鼠CD3+CD4+T细胞中CD4+RORγt+细胞比例及CD4+IL-17+细胞比例(P<0.01、P<0.05)。2.电针抑制CIA大鼠IL-33产生及滑膜肥大细胞浸润。免疫组织化学检测结果显示,与空白对照组相比,CIA模型组与CI A模型+电针治疗组滑膜组织中IL-33的含量明显升高;而与CIA模型组相比,CIA模型+电针治疗组IL-33的含量显著下降(P<0.01)。ELISA检测大鼠血清及滑膜组织中IL-33的含量,其结果趋势与免疫组织化学结果一致(P<0.01),且血清中IL-33的含量和滑膜组织中IL-33的含量呈现正相关(r=0.9196,p=0.0012)。进一步RT-PCR检测结果显示,与CI A模型组相比,电针能明显降低血清中IL-33m RNA表达水平(P<0.01)。甲苯胺蓝染色结果显示,与CIA模型组相比,电针能明显减轻CIA大鼠滑膜组织肥大细胞浸润,减少肥大细胞脱颗粒(P<0.05、P<0.01)。ELI SA检测结果显示,与CIA模型组相比,电针能明显减少滑膜组织中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-17的释放(P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05),且经分析发现,滑膜肥大细胞的数量与滑膜组织中炎症因子的释放呈现正相关。3.电针抑制IL-33诱导的肥大细胞炎症。分离各组大鼠腹腔肥大细胞,与IL-33共培养,使用甲苯胺蓝染色鉴定分离的肥大细胞,使用ELISA检测肥大细胞炎症因子的释放。结果显示,与CIA模型组相比,CIA+电针治疗组中肥大细胞TNF-α、IL-5、IL-1β、IL-6、MCP-1和IL-13的分泌及组胺的释放均明显减少(P<0.05、P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.01、P<0.05)。分光光度法检测结果显示,与CIA模型组相比,电针能明显抑制肥大细胞体外β-氨基己糖苷酶的释放(P<0.05)。ELISA检测体外培养的肥大细胞上清中相关抗体的含量,结果显示,上清中IL-5及IL-13的含量均分别与抗CⅡIg G1和抗CⅡIg G2a含量呈正相关。流式细胞学检测结果显示,IL-1β和IL-6的含量均与CD3+CD4+T细胞中CD4+IL-17+细胞比例成正相关。RT-PCR检测结果显示,电针能明显下调肥大细胞mi R-155的表达但是对IL-33受体ST2没有影响(P<0.01)。免疫蛋白印迹检测结果显示,电针可明显下调肥大细胞胞浆蛋白p-IKKα/β的表达水平(P<0.001)及胞核蛋白NF-κB p65的表达水平(P<0.005)和减小胞浆中p-P38/p38比值(P<0.005),以及提高胞浆蛋白IκBα的表达水平(P<0.01)。4.电针经由mi R-155抑制IL-33调节的肥大细胞炎症减缓大鼠CIA。分离大鼠腹腔肥大细胞,对CIA+电针治疗组肥大细胞进行mi R-155mimic转染使其mi R-155过表达(P<0.005)。ELISA检测结果显示,与CIA+电针治疗组相比,在IL-33刺激下,经mi R-155 mimic转染后的肥大细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、IL-5和IL-13的释放量明显上升(P<0.01、P<0.01、P<0.01、P<0.05、P<0.05、P<0.05)。蛋白免疫印迹分析结果显示,与CIA+电针治疗组相比,在IL-33刺激下,经mi R-155 mimic转染后的肥大细胞胞浆蛋白中p-P38/P38的值及p-IKKα/β蛋白表达水平显著上调(P<0.005、P<0.005),而IκBα蛋白表达水平显著下降(P<0.01);胞核蛋白NF-κB p65的表达水平显著上升(P<0.005)。结论1.电针“足三里”穴对胶原诱导的关节炎症具有明显的改善作用。电针“足三里”穴减轻CIA大鼠滑膜组织炎性细胞浸润,抑制其体内Ⅱ型胶原抗体的含量及炎性细胞因子TNF-α,IL-1β,IL-6,IL-17的分泌,抑制C IA大鼠脾脏Th17细胞激活,是其发挥调节CIA大鼠亢进的免疫功能效应的关键。2.电针通过减少CIA大鼠滑膜组织肥大细胞的浸润,减少局部滑膜组织及全身血液中IL-33的生成,抑制IL-33诱导的肥大细胞炎症反应,从而发挥其治疗作用。3.mi R-155参与了电针抑制CIA大鼠中IL-33诱导的肥大细胞炎症反应。综上,我们推测电针可能经由mi R-155抑制IL-33调节的肥大细胞炎症,从而减缓胶原诱导性关节炎。