大鲵遗传多样性及皮肤附属物特性研究

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大鲵作为中国特有濒临灭绝的二级保护动物,国家已经建立16个专业大鲵保护区及一些自然保护区(大鲵列为保护名录),对大鲵的适生环境和人工繁殖技术开展研究,逐步建立起大鲵人工繁育体系,有效地保护该物种。目前大鲵保护存在一些不足:(1)大鲵种质资源混乱,近亲繁殖,导致大鲵种质的退化,不利于物种的长期生存,有必要对人工养殖大鲵的亲本进行遗传多样性及亲缘关系分析,辨别其混乱的亲本,提供合理的保护策略。(2)缺乏可持续保护方法,大鲵皮肤附属物分泌物和蜕皮是大鲵自然生理特征,可以多次产生,属于可以利用的可再生物质,对这部分加以研究,利用好这部分物质,更适合大鲵资源的长远保护。本课题以大鲵皮肤附属物分泌物和蜕皮为研究对象,建立了非伤害取样技术提取基因组DNA,筛选SSR标记位点,分析了大鲵亲本的遗传多样性和亲缘关系,为制定大鲵长远保护策略提供依据。对其组成及理化性质进行分析,并结合动物模型评价其具体功效,为充分合理利用大鲵皮肤附属物提供支持:(1)大鲵亲本的遗传多样性分析:建立了非损伤大鲵样本组织替代技术,从大鲵分泌物和蜕皮中提取大鲵基因组DNA。通过扩增线粒体12S序列证实该方法获得的DNA可以用于遗传结构分析。从这种组织样本获得的基因组DNA扩增出34个微卫星序列,其中10个微卫星序列具有良好的多态性,用于大鲵资源遗传多样性分析。张家界大鲵核心保护区人工养殖大鲵亲本具有丰富的遗传多样性,聚类分析属于4个种群。(2)分泌物的理化性质及活性分析:为高度含水的凝胶样物质,主要成分为蛋白质。仅溶于5%(V/V)醋酸溶液和蛋白酶溶液,具有很强的粘性,其平均分子量为3.61×106。分泌物可溶组分含有蛋白水解酶活性和磷脂酶A2活性。没有明显抗菌活性,仅在早期有微弱抑制微生物生长的活性。具有抗氧化特性,对DPPH和ABTS清除效果显著,在0.6mg/ml其清除活性达到了90.83%和93.12%,热变性制备的多肽在0.05mg/ml对ABTS的清除活性达到了70.90%。(3)大鲵分泌物的毒性及抗肿瘤活性:大鲵皮肤分泌物可溶组分对小鼠有致死活性,LD50(腹腔)值为32.95mg/kg,其活性组分为热不稳定蛋白质。解剖死亡个体发现肺部组织发生明显变化,有充血现象,抽搐可能会导致小鼠死亡。大鲵分泌物对小鼠产生一些局部影响,可诱导小鼠显著的疼痛活动,促进血管通透性增加,导致持续性肿胀,没有引起明显的出血活性,可使肌肉组织肿胀坏死。体内抑制腹水瘤细胞的生长,减少腹水瘤细胞的数量,延长存活期,分泌物水溶物能明显改善小鼠血液指标,对肝脏结构没有带来明显损伤。体外对肿瘤细胞和正常细胞均有抑制生长活性,其抑制活性对不同的细胞存在差异,抑制活性机制不是促使肿瘤细胞的凋亡。(4)大鲵蜕皮的组成及治疗烧烫伤的活性:大鲵蜕皮含有丰富的氨基酸、矿物元素和8种脂肪酸。大鲵蜕皮大剂量软膏可明显提高创面愈合率,缩短创面愈合时间,加速创面愈合,抑制促炎因子活性可能是发挥作用的机制之一。
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