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正常生理状态下,雌性动物促卵泡素（follicle stimulating hormone,FSH）主要促进卵巢中卵泡的生长、促黄体素受体（luteinizing hormone receptor,LHR）的表达以及卵母细胞减数分裂能力的获得。在卵泡膜细胞中,促黄体素（luteinizing hormone,LH）与其受体结合,促进雄烯二酮（androstenedione）合成并最终到达颗粒细胞。同时,FSH诱导卵泡颗粒细胞中P450芳香化酶（CYP19）活化,将雄烯二酮转变为雌酮;雌酮又在17β-羟基类固醇脱氢酶（17β-hydroxyl steroid dehydrogenase,HSD-17B）的作用下转变为17β-雌二醇（17β-estradiol,17β-E2）。合成的雌激素又通过其核受体（estrogen nuclear receptors,ERs）和跨膜的G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptor,GPR30）介导而发挥生理作用。也就是说,FSH通过促进雌激素合成,并可能在雌激素受体介导下间接发挥生理作用。有研究已经表明,将不同浓度的FSH,或将FSH与促卵泡素受体抑制剂一起添加到绵羊COCs成熟培养液中时,雌激素核受体ERα和ERβ的m RNA和蛋白表达水平均不会发生显著的变化,说明FSH的间接生理作用不是通过ERs（ERα和ERβ）实现的。那么,FSH是如何通过雌激素间接发挥生理作用的,是否通过调控雌激素膜受体GPR30,介导卵母细胞成熟以及卵丘扩展,是需要探明的科学问题。因此,本研究以小鼠卵丘卵母细胞复合体（cumulus–oocyte complexes,COCs）为试验模型,探讨FSH对小鼠卵母细胞体外成熟的影响,并对其作用机制进行研究。研究内容及结果如下:（1）首先对体外成熟培养小鼠COCs过程中FSH的浓度进行筛选。设置0 IU/m L、0.01 IU/m L、0.1 IU/m L、1 IU/m L、10 IU/m L FSH的浓度梯度,添加到小鼠COCs体外陈述培养液,体外培养16 h后COCs卵丘扩展指数（cumulus spreading index,CEI）统计结果显示,添加0.1 IU/m L FSH可最有效地促进体外成熟培养的小鼠COCs的卵丘细胞扩展。利用芳香化酶的特异性抑制剂来曲唑（Letrozole,Let）,进一步对E2合成相关的芳香化酶基因进行定量研究。q RT-PCR结果显示,FSH组CYP51、HSD-17B1的m RNA水平相对于对照组和FSH+Let组显著上调（P＜0.05）,但是各组间CYP19A1的转录水平无显著差异（P＞0.05）。利用ELISA检测小鼠COCs体外成熟培养过程中添加FSH时,培养液中雌激素水平的变化。结果显示,与对照组相比,FSH能促进小鼠COCs合成E2。这表明,在小鼠COCs体外成熟培养过程中,添加0.1 IU/ml FSH能够激活卵丘细胞中的芳香化酶,使雄烯二酮转化为E2,促进了内源性雌激素的合成。（2）基于上述研究,利用雌激素膜受体GPR30的选择性抑制剂G15,进一步研究了在小鼠COCs体外成熟培养过程中,添加FSH促进COCs合成的E2是否通过雌激素膜受体GPR30,介导雌激素对卵母细胞成熟的调控。首先,对小鼠卵丘细胞和COCs进行免疫荧光染色、激光共聚焦显微镜分析表明,小鼠卵丘细胞和卵母细胞胞质膜上均存在GPR30表达,但是相较于卵丘细胞,卵母细胞质膜上GPR30的表达量很少。进一步对成熟培养过程中GPR30的m RNA水平及蛋白水平的变化进行研究。q RT-PCR分析结果显示,分别用FSH+G15、FSH+Let或FSH+G15+Let处理小鼠COCs后,GPR30 m RNA水平较FSH组明显降低（P＜0.05）;Western blotting检测结果显示,GPR30蛋白水平与m RNA水平呈相同的趋势,也出现明显的下降（P＜0.05）。说明,FSH通过激活小鼠COCs的芳香化酶,促进内源性雌激素的合成,进而间接调控GPR30的表达。（3）根据上述研究结果,进一步研究了FSH在E2/GPR30介导的小鼠卵丘细胞扩展过程中的作用。我们发现,在小鼠COCs体外培养8 h后,FSH组COCs相较于对照组和其他添加GPR30信号通路关键分子ERK的小分子抑制剂（G15,Let,PD98059）组,卵丘细胞扩展更明显,有显著差异（P＜0.05）;培养16 h后,FSH组相较于对照组和其他添加小分子抑制剂组,卵丘细胞会进一步扩展。CEI计算结果显示,培养8 h后,FSH组、FSH+G15组、FSH+PD98059组、FSH+G15+PD98059组、FSH+G15+Let+PD98059组CEI均高于对照组CEI（P＜0.05）;然而培养16 h后,FSH组、FSH+Let组、FSH+G15组的CEI高于对照组（P＜0.05）,但对照组与FSH+PD98059组、FSH+PD98059+G15组或FSH添加三种小分子抑制剂组之间的CEI没有显著差异（P＞0.05）。另外,体外培养小鼠COCs 6 h后,对上述各组中与卵丘扩展有关基因（HAS2,PTGS2,PTX3,TNFAIP6）的相对表达进行研究结果显示,与对照组和添加小分子抑制剂组相比,FSH显著增加了COCs中HAS2和PTGS2的m RNA表达（P＜0.05）。除对照组外,各组间PTX3、TNFAIP6的m RNA表达无显著性差异（P＞0.05）,但是各组间的PTX3、TNFAIP6的m RNA水平均明显高于对照组（P＜0.05）,表明FSH诱导的小鼠卵丘细胞的扩展受到GPR30介导的雌激素信号的调控。（4）基于上述研究结果,进一步研究了FSH在E2/GPR30介导的小鼠卵母细胞成熟过程中的作用。第一极体（PBⅠ）排出率的统计结果显示,FSH组中PBⅠ的排出率明显高于对照组和其他添加小分子抑制剂组（P＜0.05）。对卵母细胞成熟相关基因（GDF9,BMP15,GREM1）的m RNA水平进行定量研究结果显示,与对照组相比,FSH组中GDF9和BMP15的m RNA水平明显降低（P＜0.05）,即使添加不同的抑制剂,FSH的抑制作用也没有被逆转;然而FSH组的GREM1 m RNA表达水平却明显高于其他各组（P＜0.05）,表明FSH诱导的小鼠卵母细胞体外成熟受GPR30介导的雌激素信号的调控。（5）进一步采用蛋白质免疫印迹法检测GPR30介导的E2信号通路对小鼠COCs中ERK1/2的磷酸化水平的影响。结果显示,FSH处理小鼠COCs 6 h后,相比于对照组,ERK1/2的磷酸化水平会明显升高（P＜0.05）;然而G15、Let、PD98059单独添加或组合添加却明显降低了FSH对ERK1/2磷酸化水平的促进作用（P＜0.05）。表明添加FSH促进COCs合成的E2,能通过GPR30上调ERK1/2的磷酸化,进而促进小鼠卵丘细胞的扩展和卵母细胞的成熟。综上所述,在小鼠COCs体外成熟培养过程中,FSH能通过激活芳香化酶,使雄烯二酮转化为E2,进而通过激活GPR30,促进其下游ERK1/2磷酸化,最终促进了卵丘细胞的扩展和卵母细胞的成熟。