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研究背景骨肉瘤(Osteosarcoma)是临床较为常见的恶性肿瘤之一,约占骨原发性肿瘤的20%,有5%发生于颌骨,颌骨骨肉瘤占口腔颌面部恶性肿瘤的5%。骨肉瘤恶性程度极高,进展速度较快,并且容易转移和复发,预后极差。目前治疗骨肉瘤的主要方法是手术切除辅以术前化疗,5年生存率为60%-70%,但对于复发和转移的骨肉瘤仍无有效的治疗手段。因此,探寻骨肉瘤的发病机制,寻找有效、低毒的治疗方法便成了目前研究骨肉瘤的热点之一。植物激素是由植物自身代谢产生的一类有机物质,调控着植物细胞的分裂与伸长、组织与器官的分化、开花与结实、成熟与衰老以及休眠与萌发等各个方面的生理作用。目前人们已将其调控植物生长及凋亡的这一作用用于抗肿瘤的治疗中,并取得了一些成绩。吲哚乙酸(indole-3-acetic, IAA)又名生长素,作为植物激素的一种,在促使植物生长,促进愈伤组织形成和诱导生根等方面起着重要的作用。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)是一种含有激素的植物过氧化物酶,它可氧化包括吲哚乙酸在内的一系列底物。由于IAA在动物体内有较高的耐受性,不易被动物自身的酶氧化,因此选择HRP在肿瘤组织内氧化IAA,使之产生有毒的代谢产物,来诱导肿瘤细胞的凋亡。而当IAA和HRP单独作用时,则不会对动物组织产生任何毒性效应。鉴于IAA/HRP对不同细胞的敏感性存在差异,本研究选择了人成骨肉瘤MG-63细胞株,观察其对该细胞的生长抑制作用,为植物激素治疗骨肉瘤提供实验和理论依据。目的本课题以人成骨肉瘤MG-63细胞株为研究对象,通过观察IAA/HRP作用后,细胞的形态、细胞内活性氧的水平、诱导凋亡的情况、以及凋亡相关基因的表达,探讨IAA/HRP对MG-63细胞的生长抑制作用,并通过抗坏血酸的抗氧化作用,从侧面分析其产生细胞增殖抑制作用的机制,从而为IAA/HRP应用于骨肉瘤的临床治疗提供实验和理论依据。材料和方法1MG-63细胞株购自中国科学院上海细胞库。2IAA. HRP和抗坏血酸均购自sigama公司。3光镜观察IAA/HRP作用于MG-63细胞后细胞的数量及形态的改变。4通过CCK-8法初步探讨IAA/HRP作用于MG-63细胞的量效和时效关系,实验分组：对照组1瓶,只加完全培养基,不加干预,实验组4瓶(其培养基中HRP的浓度均为1.2mg/L,IAA的浓度分别为25、50、100、200μmol/L),测其作用于MG-63细胞24h、48h、72h、96h后的OD值,并计算各组细胞的增殖抑制率,明确抑制MG-63细胞生长的最佳用药浓度,和作用时间。5另外采用CCK-8检测不同浓度(25、50、100、200gmol/L)的抗坏血酸与上个实验检测所得的较佳浓度的IAA/HRP联合作用,经OD值分析抗坏血酸抑制IAA/HRP作用的较佳浓度。6用Annexin V-FITC&PI法通过流式细胞仪测100μmol/L的IAA和1.2mg/L的HRP联合用药作用于MG-63细胞时,细胞内活性氧(ROS)的水平及其诱导细胞凋亡的情况,并检测抗坏血酸阻止这一过程的效果。7采用免疫细胞化学方法检测IAA/HRP联合用药对MG-63细胞内抑癌相关基因PTEN蛋白表达的改变。8利用PCR分析凋亡相关基因Caspase-3和Bcl-2的mRNA表达水平的改变,探讨IAA/HRP抑制MG-63细胞的机制。结果1细胞数量及形态的改变：正常的MG-63细胞在未加药物的对照组贴壁良好,细胞呈长梭形,细胞核圆形,胞质透亮。经过IAA联合HRP作用MG-63细胞后,发现细胞数目变少,脱落悬浮的细胞变多,细胞形态稍有圆钝,细胞核变大,胞质内颗粒增多,胞浆颜色加深,随着干预时间的增加,脱落的细胞碎片增多明显。2IAA/HRP对MG-63细胞增殖的影响：随着IAA浓度的增加,MG-63细胞增殖抑制率明显上升,除了25μmol/L的实验组外,其他各组差异均有统计学意义(P<0.05)；且随着时间的延长,其增殖能力也下降,说明IAA/HRP对MG-63细胞的抑制作用具有时间和浓度相关性。且IAA的最佳浓度为100μmol/L,较适合的作用时间为48h。另外,抗坏血酸的应用,使细胞增殖抑制率明显降低,由此证明抗坏血酸能有效拮抗IAA/HRP对MG-63细胞增殖抑制的作用。3细胞凋亡和细胞内活性氧的水平：经过100μmol/LIAA联合1.2mg/LHRP作用于MG-63细胞后,细胞内活性氧水平明显增高,且凋亡加剧,其与对照组的差别具有统计学意义(P<0.05)。4免疫细胞化学分析PTEN蛋白的表达：IAA联合HRP实验组的PTEN表达量较对照组明显增高,且抗坏血酸能有效阻止这一过程。5PCR检测凋亡相关基因的表达：IAA/HRP联合作用后,可使MG-63细胞内促凋亡基因Caspase-3mRNA表达增强,使抑凋亡基因Bcl-2mRNA的表达减弱(P<0.05)。结论1IAA联合HRP作用于MG-63细胞时,可使细胞的生长受到抑制,且存在量效和时效关系,而抗坏血酸可以有效阻止这一过程。2IAA/HRP可提升MG-63细胞内的活性氧水平,并能诱导该细胞凋亡。3细胞内抑癌基因PTEN蛋白表达增多可能是IAA/HRP抑制MG-63细胞增殖的机制之一。4IAA/HRP诱导MG-63细胞凋亡的作用机制可能与促凋亡相关基因Caspase-3的增加和抑凋亡基因Bcl-2的减少有关。