论文部分内容阅读
目的:汉坦病毒(Hantavirus,HV)是肾综合征出血热(Hemorrhagic Fever with Renal Syndrome,HFRS)的病原体,人感染后可导致HFRS和汉坦病毒肺综合征(Hantavirus Pulmonary Syndrome,HPS)两种严重的疾病。HV的包膜糖蛋白(Glycoprotein,GP)可刺激机体产生中和抗体,GP包括G1和G2两种蛋白。本文将HV编码G1的M1基因在巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris,P.pastoris)表达系统中进行了克隆和表达,并对表达产物进行鉴定。 内容和方法:使用Vero-E6细胞系分别增殖HV汉滩型(HTN)Z10株和汉城型(SEO)L99株。待HV增殖到一定程度,即免疫荧光法检测细胞中HV感染量达+++～++++时,提取总RNA,RT-PCR扩增编码G1蛋白的M1基因片段,连接入pMD18-T simple载体,测序验证目的片段。使用限制性内切酶Xba Ⅰ、Kpn Ⅰ对重组质粒进行双酶切以获得目的片段,经纯化后,连接入经同样内切酶双酶切的毕赤酵母分泌表达载体pPICZαA,接头测序验证其读码框架。将重组表达载体经BstX Ⅰ酶切线性化后电转化入处于感受态的P.pastoris,重组菌株经Zeocin筛选,将阳性重组子传代4次以稳定其性状。提取重组菌株染色体DNA,PCR检测目的片段是否整合入P.pastoris染色体。使用甲醇诱导法对重组菌株进行目的蛋白的诱导表达,并应用Westem Blot和Dot Blot对表达产物进行鉴定。 结果:M1基因RT-PCR产物连接入pMD18-T simple载体后,获得重组质粒pMD18T-Z10M1、pMD18T-L99M1。经测序后与GenBank登录的核苷酸序列进行比较,与Z10株RNA序列(AF 276987)相比,目的片段有9个碱基突变:与L99株mRNA序列(AF 288298)相比,目的片段有5个碱基突变。经限制性内切酶KpnⅠ、XbaⅠ对其进行双酶切并定向克隆入经同样内切酶双酶切的质粒载体pPICZαA中,重组质粒分别命名为pPICZαA-Z10M1、pPICZαA-L99M1。