广藿香[Pogostemon cablin(Blanco)Benth.]为唇形科刺蕊草属植物,以干燥地上部分入药,性辛、微温,具有芳香化浊,和中止呕,发表解暑的功效[1],是常用的传统中药。本研究以实验室建立的广藿香组培技术和悬浮细胞系建系方法为基础,优化建立了稳定的广藿香悬浮细胞系;研究了水杨酸和茉莉酸甲酯诱导子对广藿香悬浮细胞生长及百秋李醇含量的影响;以原生质体产量和活力为评价指标,研究原生质体分离纯化过程的主要影响因素,建立了高效的广藿香悬浮细胞原生质体分离纯化方法体系;利用液体浅层培养等培养方法,及不同培养基成分和不同培养条件对原生质体进行研究,得到了广藿香原生质体培养至第一次分裂的条件。主要研究结果如下:(1)广藿香悬浮细胞系的优化广藿香悬浮细胞系的优化结果是:广藿香疏松愈伤组织的初次诱导培养时间为21 d;以“将疏松愈伤组织适当保持完整和生长极性,分成2-4块,每瓶新培养基接种2-3块”的接种方法进行继代培养最有利于团块状疏松愈伤组织的生长;以8 g/100 mL的细胞接种量进行继代培养最有利于广藿香悬浮细胞的生长,可获得大量均匀分散的黄白色悬浮细胞。(2)诱导子对广藿香悬浮细胞生长及百秋李醇含量的影响在广藿香悬浮细胞生长周期的不同阶段加入1 mg/L水杨酸和5 mg/L茉莉酸甲酯,培养结束后测定细胞鲜重、细胞干重和百秋李醇含量,研究了水杨酸和茉莉酸甲酯对悬浮细胞生长及百秋李醇含量的影响。在不同阶段添加水杨酸,广藿香悬浮细胞生长情况与空白细胞组之间均无显著性差异,添加时间为第8 d与第15 d之间的细胞鲜重和细胞干重有极显著差异;添加时间为第8 d(迟缓期末期)时对广藿香悬浮细胞生长有一定的促进作用,细胞鲜重和细胞干重均为最高,分别是558.8474 g/L和12.0912 g/L。各水杨酸处理组均可提高广藿香悬浮细胞内百秋李醇的含量,之间无显著性差异,但与空白细胞组之间均有极显著性差异;水杨酸添加时间为第9d(对数生长期前期)时的细胞内百秋李醇含量最高,为0.0502mg/g,与空白细胞组(0.0061mg/g)相比,增加8.2295倍。在不同阶段添加茉莉酸甲酯,广藿香悬浮细胞生长情况与空白细胞组之间均无显著性差异,添加时间为第9d与第15d之间的细胞鲜重差异显著。在第9d时添加茉莉酸甲酯对广藿香悬浮细胞的正常生长无明显抑制作用,细胞鲜重和细胞干重均为最高,分别是523.9138g/l和10.8918g/l。各茉莉酸甲酯处理组都可促进广藿香悬浮细胞内百秋李醇的合成,之间的差异极显著,与空白细胞组之间均有极显著差异性;在第9d(对数生长期前期)时加入茉莉酸甲酯的细胞内百秋李醇含量最高,为0.1684mg/g,增加27.6065倍。(3)广藿香悬浮细胞原生质体的分离纯化以广藿香悬浮细胞为材料,分别研究了酶液组合、酶解时间、渗透压调节剂甘露醇的浓度、悬浮细胞继代培养时间、不同孔径滤网和离心条件对原生质体分离纯化的影响。广藿香悬浮细胞原生质体分离纯化的最佳方法体系是:在最佳酶液组合为1.5%纤维素酶、0.8%果胶酶和0.5%半纤维素酶,最佳渗透压调节剂甘露醇的浓度为0.4mol/l条件下,配制酶液与继代培养9-14d的广藿香悬浮细胞混合,以26℃、50r/min避光振荡酶解12h,可分离出大量原生质体。依次经40→100→200目多级滤网过滤收集得原生质体粗提液,再以600r/min离心5min条件下进一步纯化,最终得到高质量的广藿香悬浮细胞原生质体,产量达到13.05×105个/g,活力达到80.98%。(4)广藿香悬浮细胞原生质体的培养本研究对广藿香悬浮细胞原生质体进行了液体浅层培养法、微滴培养法、固液双层培养法和看护培养法的探索,并比较了液体浅层培养法中4种不同培养基和不同光照条件的影响。以ms培养基附加0.1mg/l2,4-d和3mg/l6-ba作为原生质体培养基,黑暗条件下,液体浅层培养12d的广藿香悬浮细胞原生质体能发生第一次分裂,弱光条件下,15d-18d能观察到原生质体分离,光照时长12h下则需要25d左右才观察到第一次分裂。表明黑暗培养条件下可能更有利于广藿香悬浮细胞原生质体的生长发育。通过微滴培养法可观察到原生质体的细胞质变浓厚,但在培养后期逐渐褐化,未观察到分裂现象;以固液双层培养法对比了两种原生质体培养基,原生质体的形状发生了改变,但未观察到第一次分裂;以看护培养法培养原生质体30 d,未观察到有形成再生小愈伤组织。