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找寻适宜的信号肽并进行信号肽结构优化是实现特定酶分子分泌表达的基础。本文选择蛋白质谷氨酰胺氨基水解酶(Protein-L-glutamine amidohydrolase;PGase,EC 3.5.1.44)作为模式酶蛋白,从地衣芽孢杆菌中筛选出适合介导PGase分泌的Tat信号肽,进一步运用现代分子克隆、定点突变等技术进行信号肽结构优化,以期实现PGase的分泌表达,获得了如下有益结果:(1)PGase编码基因及其去除前肽PGase的编码基因,在大肠杆菌中进行异源表达,通过SDS-PAGE检测进行验证,分别得到35 kDa和25 kDa条带,均为预期目的条带,与预期大小相符,但PGase在大肠中并未表现出相应的酶活性。(2)根据信号肽产物选择出3种地衣芽孢杆菌来源的TAT信号肽,分别缩写为AG、CG、HG,运用PCR扩增等技术构建了含信号肽序列的分泌表达载体,进一步将PGase编码基因克隆入其中,转化枯草杆菌WB600,得到重组菌WB600(pHY-PAG)、WB600(pHY-PCG)、WB600(pHY-PHG)。经摇瓶发酵及PGase酶活测定,其中WB600(pHY-PAG)的PGase酶活表现较为明显。(3)根据杆菌信号肽自身结构中N端正电荷数对信号肽的加工效率会产生较大影响,进而对分泌效率同样产生影响为依据,对AG序列的N端定点突变并评价对介导PGase分泌的影响,WB600(pHY-PAG II)所产PGase酶活最高,达到0.23 U/mL。(4)进一步以WB600(pHY-PAG II)为研究对象,优化了其发酵条件。结果显示,菌龄8 h,接种量5%,摇瓶装液量75 mL/250 mL,摇床转速200 r/min,发酵周期24 h,碳源为乳糖;氮源为蛋白胨+NH4N03时,菌株的产酶能力最高为0.55 U/mL。(5)研究了重组PGase的酶学性质及应用价值。重组酶的最适pH值为7.0,最适温度为60℃,在pH 6-8时酶活力保持最稳定,在20℃-40℃环境下储存1 h,酶活力仍保持稳定。Ca2+对PGase有明显促进作用,Fe3+、Cu2+、Ag+、SDS对PGase有明显抑制作用,其他离子及抑制剂无明显影响。重组酶可使高分子量蛋白质(酪蛋白)脱酰胺,该酶对大豆分离蛋白有较好的脱酰胺效果。