【摘 要】
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猪附红细胞体（Mycoplasma suis,M.suis）是一种无法体外培养的血营养型支原体。该病原体能引发猪慢性或急性传染性贫血,且感染病猪常伴随其他疾病的混合感染,这使得猪附红细胞体病的诊断更加困难。目前,猪附红细胞体病的防治主要依赖于化学药物的控制,但化学药物的滥用很容易诱发机体产生耐药性,因此疫苗的研制将成为防治猪附红细胞体病的最有效的措施之一。α-烯醇酶是一种已经报道过的M.suis膜
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猪附红细胞体（Mycoplasma suis,M.suis）是一种无法体外培养的血营养型支原体。该病原体能引发猪慢性或急性传染性贫血,且感染病猪常伴随其他疾病的混合感染,这使得猪附红细胞体病的诊断更加困难。目前,猪附红细胞体病的防治主要依赖于化学药物的控制,但化学药物的滥用很容易诱发机体产生耐药性,因此疫苗的研制将成为防治猪附红细胞体病的最有效的措施之一。α-烯醇酶是一种已经报道过的M.suis膜表面的粘附蛋白,也是一种具有免疫原性和表面活性的蛋白;同时,它也是研制预防猪附红细胞体病疫苗的候选抗原之一。本试验利用编码α-烯醇酶的ENO基因序列（序列号:CP002525.1）,对其进行优化与合成,并根据合成的基因序列设计了一对特异性引物。以人工合成的ENO基因为模板,PCR扩增出目的基因序列大小为1632bp。将目的基因克隆到原核表达载体pET-15b,然后优化重组蛋白诱导表达和纯化条件。结果显示,该重组蛋白存在于上清和沉淀中。表达的目的蛋白大小为61 Ku,且具有很好的反应原性。将小鼠分为4组,分别免疫rMsEno、E.colieno、PBS和E.coli,并收集免疫前、一免后、二免后和三免后的血清样品。通过本试验建立的间接ELISA方法检测特异性抗体IgG,测定IgG1和IgG2a水平以及细胞因子IL-4和IFN-γ的水平;另外,通过脾脏淋巴细胞增殖试验反映了小鼠机体内T淋巴细胞的增殖情况,初步评价本试验制备的重组蛋白对小鼠的免疫效果。检测结果显示,免疫组A和免疫组B中特异性抗体IgG,IgG1和IgG2a抗体水平均极显著高于对照组（P＜0.01）;免疫组A和免疫组B中IL-4和IFN-γ水平均极显著高于对照组（P＜0.01）;而且,免疫组A与免疫组B之间存在显著性差异（P＜0.05）。小鼠脾淋巴细胞增值试验结果表明,在重组蛋白rMsEno和大肠杆菌转化体E.colieno的刺激作用下,免疫组A和免疫组B中T淋巴细胞增值指数均极显著高于对照组（P＜0.01）;在ConA的刺激作用下,免疫组A和免疫组B中T淋巴细胞增值指数均显著高于对照组（P＜0.05）。将仔猪分为3组,分别免疫rMsEno、E.colieno和PBS,并收集免疫前、一免后、二免后和三免后的血清样品。通过ELISA方法检测血清中特异性抗体IgG,IgG1和IgG2a水平以及细胞因子IL-4和IFN-γ的水平;另外,通过流式细胞术测定免疫猪脾脏淋巴细胞中CD4+和CD8+的水平,检测结果显示,免疫组A和免疫组B猪血清中特异性抗体IgG,IgG1和IgG2a抗体水平均极显著高于对照组（P＜0.01）;免疫组A和免疫组B的IL-4和IFN-γ细胞因子水平均极显著高于对照组（P＜0.01）;而且,免疫组A与免疫组B之间存在显著性差异（P＜0.05）。此外,T淋巴细胞亚群CD4+、CD8+分析结果表明,CD4+水平免疫组A和免疫组B极显著高于对照组C（P＜0.01）;CD8+水平免疫组A和免疫组B极显著高于对照组C（P＜0.01）;此外,CD4+/CD8+比值免疫组和对照组之间并无显著性差异。综上所述,本试验利用猪附红细胞体ENO基因成功构建了原核重组表达质粒,并诱导表达获得了重组蛋白rMsEno,该蛋白具有良好的反应原性。将纯化后的rMsEno和E.colieno接种昆明小鼠和仔猪,能诱使小鼠和仔猪产生较强的免疫应答反应,为研制猪附红细胞体病的疫苗夯实了基础。
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